INFORME DE LA PRACTICA N 04 ANALISIS DE SECUENCIAS DE ADN Y USO DEL BANCO DE GENES BLASTn y ciestionario

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental INFORME: ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE ADN Y USO DEL BANCO DE GENES BLAST Biotecnología Asesor: Dr. Hebert Soto Responsables: Arevalo Navarro, Stefani Brilly 2019205021 Luna Merma, Mayra Alexandra 2019205034 VII Ciclo Ilo, Moquegua, Perú 2021 1

2. ÍNDICE INTRODUCCIÓN 3 OBJETIVOS 4 OBJETIVO PRINCIPAL 4 OBJETIVOS SECUNDARIOS 4 RESULTADO 17 CONCLUSIONES 19 ANEXOS 19 2

3. INTRODUCCIÓN El ADN es una de las moléculas más importantes para la vida. Consiste de una doble hélice donde cada una de las cadenas es un polímero integrado por miles o incluso millones de nucleótidos (Stansfield 1992). Cada nucleótido, está formado por un azúcar (desoxirribosa), una base nitrogenada que puede ser adenina (A), timina (T), citosina (C) o guanina (G) y un grupo fosfato (Stansfield 1992). El orden que tienen los nucleótidos en el ADN es lo que se denomina secuencia (Figura 1) y las técnicas y métodos que se utilizan para conocer esa secuencia son llamados de secuenciación (de Necochea y Canul 2004). Conocer el orden de los nucleótidos es una herramienta con infinidad de aplicaciones porque la diferencia fundamental entre todas las moléculas de ADN que forman el material genético de los seres vivos es la secuencia de estas cuatro bases nitrogenadas (de Necochea y Canul 2004). La técnica enzimática se basa en la interrupción controlada de la replicación del ADN in vitro. Se realiza una PCR del fragmento que se va a secuenciar pero, a diferencia de una PCR convencional , se utiliza un solo iniciador y se agregan dideoxinucleótidos (ddNTPs) que carecen del grupo hidroxilo en el extremo 3 y están marcados con radiactividad o con fluoróforos. Cuando se incorpora un dideoxinucleótido a la cadena en elongación, se termina su amplificación, de tal manera que al final, se tienen fragmentos de diferente longitud, cada uno terminando en un ddNTPs . Los fragmentos obtenidos, se separan y analizan electroforéticamente de manera manual o automática. Este método ha sido utilizado ampliamente en muchas líneas de investigación, generando tal cantidad de secuencias que a principios de los ochenta fue necesario crear bases de datos universales para resguardar la información y hacerla accesible a los usuarios. En 1982, año en que se crea el Genbank a través del National Center for Biotechnology Information (NCBI), existían más de 2 000 secuencias y para principios del 2011 esta base de datos estaba integrada por más de 100 000 000 secuencias. En cuanto a genomas completos, en total se tienen registrados y en proceso de ser secuenciados cerca de 6.000 distintos, siendo los virus los que mayor número de variantes secuenciadas presentan (NCBI 2011). BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) es un programa informático de alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN, ARN o proteínas. El programa es capaz de comparar una secuencia problema contra una gran cantidad de secuencias que 3

4. se encuentren en una base de datos. El algoritmo encuentra las secuencias de la base de datos que tienen mayor parecido a la secuencia problema. OBJETIVOS OBJETIVO PRINCIPAL ●Analizar 15 secuencias de ADN con el apoyo del programa Bioedit y el BLAST OBJETIVOS SECUNDARIOS ●Aprender a utilizar los programas bioinformáticos como el programa Bioedit y BLAST ●Lograr que la bioinformática aporte su capacidad para facilitar y asegurar la gestión , almacenamiento , salvaguarda,recuperación y presentación de la información biotecnológica que se maneja en el ambiento ambiental METODOLOGÍA BioEdit BioEdit es un editor de alineación de secuencia biológica escrito para Windows 95/98 / NT / 2000 / XP / 7. Una interfaz intuitiva de documentos múltiples con características convenientes hace que la alineación y la manipulación de secuencias sean relativamente fáciles en su computadora de escritorio. Varias opciones de análisis y manipulación de secuencias y enlaces a programas de análisis externos facilitan un entorno de trabajo que le permite ver y manipular secuencias con simples operaciones de apuntar y hacer clic. 1.1 Identificar las muestras de la carpeta ●Utilizaremos 15 muestras de secuencias de ADN , las cuales rotulamos con los siguientes códigos CÓDIGO CÓDIGO CÓDIGO CÓDIGO D03_07 A02_02 E02_10 H01_15 AO3_01 E01_09 F01_11 H04_16 D04_08 B02_04 C02_06 C04_06 - F03_11 G02_14 D02_08 4

5. De los cuales se analizó cada secuencia de ADN con la ayuda del programa Bioedit 1.2 Análisis de cada secuencia en BioEdit a)D03_07 5

6. b)AO3_01 c)D04_08 d)F03_11 6

7. e)A02_02 f)E01_09 g)B02_04 7

8. h)G02_14 i)E02_10 j)F01_11 8

9. k)C02_06 l)D02_08 9

10. m)H01_15 n)H04_16 o)C04_06 10

11. 1.3Aplicación en el BLAST de cada secuencia a)D03_07 b)AO3_01 11

12. c)D04_08 d)F03_11 e)A02_02 12

13. f)E01_09 g)B02_04 13

14. h)G02_14 i)E02_10 j)F01_11 14

15. k)C02_06 l)D02_08 15

16. m)H01_15 n)H04_16 o)C04_06 16

17. RESULTADO Luego del procesamiento de las secuencias de ADN en los programas de BioEdit y BLAST se obtienen los siguientes resultados estructurados en el siguiente cuadro donde evaluamos la calidad de la secuencia entre mala , regular y Buena , Tambien indentificamos el porcentaje y la especie representative que se identifico en cada secuencia : 17

18. ESPECIE IDENTIFICADA CALIDAD DE LA SECUENCIA CÓDIGO % MALA REGULAR X X X BUENA Select seq MF442270.1? Enterobacter sp. strain ERR 838 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Select seq FR821641.1? Klebsiella oxytoca partial 16S rRNA gene, strain ZFJ-11, isolate 4 8A7d Select seq MN197858.1? Klebsiella pneumoniae strain Kafeel-2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence N.I. Select seq KJ590519.1? Enterobacter sp. CB7 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 80.49% 77.87% 73.08% D03_07 AO3_01 D04_08 F03_11 A02_02 E01_09 B02_04 G02_14 E02_10 F01_11 C02_06 D02_08 H01_15 H04_16 C04_06 X 95.81% 93.25% 72.46% 79.64% 88.89% ? 95.91% 75.43% 95.30%? 73.75% 79.04% 67.07% X X Select seq MT439098.1? Klebsiella pneumoniae strain CEMTC_3772 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Select seq FJ626320.1 Endosymbiont of Sphenophorus levis clone Field_clone_E12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus sp. BAB-4349 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Select seq MF525848.1? Enterobacter sp. strain MadaFrogSkinBac.DB-.2751 16S ribosomal RNA gene, partial sequen Select seq MN367953.1? Klebsiella pneumoniae strain SJC153 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Uncultured bacterium clone BICP1429 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Klebsiella pneumoniae gene for 16S rRNA, partial sequence, isolate: 7/17b Select seq JN969322.1? Klebsiella oxytoca strain ac1w1-1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Select seq FR677020.1? Klebsiella sp. MB42 partial 16S rRNA gene, isolate MB42 Select seq MT310826.1? Pseudomonas jessenii strain BRN6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence X X X X X X X X X 1

19. CONCLUSIONES -Se concluyo que el programa BioEdit resulta muy util para el analisis de las secuencias de AND , el cual mendiante el grafico que nos ilustra nos resulta facil interpreter la calidad de las secuencias , se distingue claramente los picos altos y bajos y con esto indicamos la calidad de la secuencia , Tambien vemos claramente la presencia de “N” en el orden lo cual podemos interpreter facilmente -Se logro manejar correctamente el programa BLAST con el cual pudimos procesar correctamente nuestras secuencias y compararlas con otras secuencias que han sido previamente caracterizadas, para así poder inferir su función. ANEXOS 1

20. ANEXO 1 CUESTIONARIO PARA EL INFORME 1.- ¿QUÉ ES EL BLASTn? Y CÓMO NOS AYUDA EN LA PRÁCTICA. BLAST es el acrónimo de Basic Local Alignment Search Tool y es el algoritmo más empleado por el NCBI. La principal característica del BLAST es su velocidad, pudiendo tomar pocos minutos cualquier búsqueda en la totalidad de la base de datos. De hecho, los resultados se presentan en pantalla inmediatamente después de calculados. El BLAST puede hacer búsquedas en una base de datos no redundante (nr) la cual tiene los registros no redundantes entre las dos bases de datos principales a nivel mundial: GenBank en USA y EMBL (European Molecular Biology Laboratories) en Europa. El BLASTn en la práctica nos ayudó a identificar las especies que más predominan en cada secuencia de ADN gracias a la gran base de datos que tiene a nivel mundial. 2.- QUE ES UNA SECUENCIA DE ADN Y COMO NOS SERVIRÁ EN INGENIERÍA AMBIENTAL? Una secuencia de ADN, secuencia de nucleótidos o secuencia genética es una sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda, con la capacidad de transportar información. Las letras son A, C, G y T, que simbolizan las cuatro subunidades de nucleótidos de una banda ADN - adenina, citosina, guanina, timina, que son bases covalentemente ligadas a cadenas fosfóricas. En el típico caso, las secuencias se presentan pegadas unas a las otras, sin espacios, como en la secuencia AAAGTCTGAC, yendo de 5' a 3' de izquierda a derecha. Una sucesión de cualquier número de nucleótidos mayor a cuatro es posible de llamarse una secuencia. En relación a su función biológica, que puede depender del contexto, una secuencia puede tener sentido o contrasentido, y ser tanto codificante o no codificante. Las secuencias de ADN pueden contener "ADN no codificante". Las secuencias pueden derivarse de material biológico de descarte a través del proceso de secuenciación del ADN. La secuencia de ADN en la ingeniería ambiental nos ayuda en diferentes aplicaciones las cuales podemos dividir en ámbitos como el estudio de ecosistemas antiguos, las interacciones planta-polinizador, el análisis de las dietas, la detección de especies invasoras, las respuestas a la contaminación o el análisis de la calidad del aire que se describen y ejemplifican en diferentes investigaciones

21. 3.- DIBUJE LA ESTRUCTURA DEL ADN E INDIQUE LA HISTORIA PARA SU DESCUBRIMIENTO. IMAGEN 1 Durante el año de 1869 el biólogo suizo Johann Friedrich Miescher, utilizó alcohol caliente y luego una pepsina enzimática, la cual separa la membrana celular y el citoplasma de la célula, lo que se quería lograr era aislar el núcleo de la célula.Este proceso se llevó a cabo con los núcleos de las células obtenidas del pus de vendajes quirúrgicos desechados y del esperma de salmón, sometiéndose a estos materiales y a una fuerza centrifuga para aislar a los núcleos y luego realizó un análisis químico a los núcleos. De esta forma Miescher identificó a un nuevo grupo de sustancias celulares a las que denominó nucleínas. Observó la presencia de fósforo, después Richard Altmann los identificó como ácidos y les dio el nombre de ácidos nucleicos. En 1914 Robert Feulgen descubrió un método para revelar el ADN, basado en el colorante fucsina. En el transcurso de los años 20, el bioquímico P.A. Levene realizó un análisis a los componentes del ADN y encontró que contenía cuatro bases nitrogenadas: citosina y timina, adenina y guanina; azúcar desoxirribosa; y fosfato. También señaló que se encontraban unidas en un orden definido el cual es: fosfato-azúcar-base, formando lo que llamó nucleótido. Levene también expuso que los nucleótidos se encontraban unidos por los fosfatos formando el ADN. James Watson y Francis CrickEllos descubrieron la forma que del ADN al interior de la célula: una hélice doble, que le permite replicarse y traspasar información de una generación a otra. Este descubrimiento fue el punto de partida para el estudio del genoma. Desde aquella fecha hasta hoy han pasado 50 años, y los avances de la Genéticahan sido enormes. 4. ¿QUÉ ES EL MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE SANGER? Esta estrategia se basa en sintetizar, de forma secuencial, una hebra de ADN complementaria a una hebra de cadena simple (que se utiliza como molde), en presencia de ADN polimerasa, los cuatro 2’-deoxinucleótidos que componen la secuencia del ADN (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y cuatro dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP). Estos últimos nucleótidos “especiales” o nucleótidos de parada, están diseñados para que carezcan del grupo 3’-OH, que permite la adición del nucleótido consecutivo, de forma que cuando uno de ellos es incorporado por la polimerasa se interrumpe la síntesis de la nueva hebra. Esto lleva a que se obtengan fragmentos secuenciados de diferente tamaño, según dónde se incorporen los dideoxinucleótidos. De este modo, y tras una simple electroforesis, se va a poder dilucidar la secuencia.

22. La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación de ADN que implica electroforesis y se basa en la incorporación aleatoria de didesoxinucleótidos que terminan la cadena mediante la ADN polimerasa durante la replicación del ADN in vitro . 5.- (SECUENCIACIÓN SANGER). DIBUJE TODA LA METODOLOGÍA DE SECUENCIACIÓN DE ADN IMAGEN 2 6.- ¿CUÁNTOS TIPOS DE SECUENCIACIÓN DE ADN EXISTE ACTUALMENTE? Si bien los métodos para secuenciar el ADN han evolucionado a lo largo de los años, todos ellos consisten en general en romper las largas cadenas de ADN en muchas piezas pequeñas y utilizar luego uno de los diversos tipos de pruebas analíticas para determinar el orden de las bases de nucleótidos que componen esas piezas. Los tipos de secuación mas usados son: Secuenciación Sanger Secuenciación masiva – Next Generation Sequencing (NSG) 7.- LOS 15 ARCHIVOS QUE USTED ANALIZÓ, A QUE SER VIVO CORRESPONDE? CÓDIGO NOMBRE DE ESPECIE IMAGEN REFERENCIAL D03_07 Enterobacter sp. D04_08 Klebsiella oxytoca partia

23. F03_11 Klebsiella pneumoniae A02_02 N.I N.I E01_09 Enterobacter B02_04 Klebsiella pneumoniae strain G02_14 Endosymbiont of Sphenophorus

24. E02_10 Bacillus F01_11 Enterobacter sp. strain C02_06 Klebsiella pneumoniae strain D02_08 Uncultured bacterium H01_15 Klebsiella pneumoniae H04_16 Klebsiell

25. C04_06 Pseudomonas jessenii stra 8.- REALICE UNA BREVE SINOPSIS DE LA HISTORIA DE LA SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS La historia de la secuenciación del ADN comienza en 1977 cuándo se publicaron los primeros métodos de secuenciación del ADN en ser aceptados y utilizados de forma general por los investigadores: la secuenciación con dideoxinucleótidos desarrollada por Sanger y Coulson y la secuenciación química de Maxam y Gilbert. Cinco años después se utilizaba el método Sanger para secuenciar el genoma completo del bacteriófago lambda, tras haberlo fragmentado y clonado en diferentes vectores.En los años siguientes, la secuenciación mediante Sanger se automatizó, lo que aumentó la capacidad de análisis e incrementó notablemente la cantidad de datos de secuencia generados y disponibles para los investigadores. Ambas mejoras impulsaron la creación de los primeros bancos de secuencias y el desarrollo de herramientas informáticas de análisis. Sin embargo, el gran motor del desarrollo de las técnicas de secuenciación y análisis del ADN fue el Proyecto Genoma Humano iniciado en 1990. Los retos técnicos y analíticos a los que tuvieron que hacer frente los investigadores responsables del proyecto favorecieron la optimización de algunas de las herramientas utilizadas y la creación de otras nuevas más acordes a la empresa de secuenciar 3.000 millones de pares de bases El primer borrador del Genoma Humano fue publicado en 2.001 y desde entonces, en paralelo a la utilización de la secuenciación como pieza clave en múltiples laboratorios de todo el mundo, se han secuenciado los genomas de muchos otros organismos modelo. El siguiente gran salto desde la automatización de la secuenciación Sanger fue el desarrollo de las técnicas de secuenciación masiva en paralelo, principales protagonistas de la secuenciación del ADN hoy en día. La gran ventaja de estos métodos es que ya no se necesita un tubo por reacción química de secuenciación sino que utiliza una biblioteca de moléculas molde de ADN fijadas en un soporte y se lanza la muestra a analizar frente a ella. Esta tecnología permite analizar cualquier

26. ADN sin que sea necesario un conocimiento previo de la secuencia. Por último, el último gran avance técnico han sido las ya denominadas tecnologías de secuenciación de tercera generación, que no requieren una amplificación previa del ADN a secuenciar, permiten obtener la secuencia de moléculas de simple cadena en tiempo real, y son capaces de leer moléculas de mayor longitud que las aproximaciones anteriores. Dentro de estas nuevas herramientas se encuentran la síntesis mediada por polimerasa de PacBio y la secuenciación mediante nanoporos. 9.- ¿QUÉ ES EL BIOEDIT? BioEdit es un editor de alineación de secuencia biológica e. Una interfaz intuitiva de documentos múltiples con características convenientes hace que la alineación y la manipulación de secuencias sean relativamente fáciles en su computadora de escritorio. Varias opciones de análisis y manipulación de secuencias y enlaces a programas de análisis externos facilitan un entorno de trabajo que le permite ver y manipular secuencias con simples operaciones de apuntar y hacer clic. 10.- QUE ES EL NCBI (National Center for Biotechnology Information), INCLUIR SU

27. HISTORIA? El Centro Nacional para la Información Biotecnológica o National Center for Biotechnology Information (NCBI) es parte de la Biblioteca Nacional de Medicina de Estados Unidos (National Library of Medicine), una rama de los Institutos Nacionales de Salud (National Institutes of Health o NIH). Está localizado en Bethesda, Maryland y fue fundado el 4 de noviembre de 1988 con la misión de ser una importante fuente de información de biología molecular. Almacena y constantemente actualiza la información referente a secuencias genómicas en GenBank, un índice de artículos científicos referentes a biomedicina, biotecnología, bioquímica, genética y genómica en PubMed, una recopilación de enfermedades genéticas humanas en OMIM, además de otros datos biotecnológicos de relevancia en diversas bases de datos. El NCBI ha tenido la responsabilidad de hacer accesible la base de datos de secuencias de ADN de GenBank desde 1992. GenBank se coordina con laboratorios individuales y otras bases de datos de secuencias tales como las del European Molecular Biology Laboratory (EMBL) y la Base de Datos de ADN de Japón.