PRACTICA N.- 05_ FILOGENIA MOLECULAR DE GENES RIBOMALES Y CONSTRUCCIÓN DE UN DENDOGRAMA

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental INFORME: FILOGENIA MOLECULAR DE GENES RIBOSOMALES Y CONSTRUCCIÓN DE UN DENDOGRAMA Biotecnología Asesor: Dr. Hebert Hernan Soto Gonzales Responsables: Arevalo Navarro, Stefani Brilly 2019205021 Luna Merma, Mayra Alexandra 2019205034 VII Ciclo Ilo, Moquegua, Perú 2022

2. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental ÍNDICE INTRODUCCIÓN 1. 3 2. OBJETIVOS 3 2.1. OBJETIVO PRINCIPAL 3 2.2. OBJETIVOS SECUNDARIOS 4 3. MARCO TEÓRICO 4 3.1 Filogenética 4 3.2 Filogenia 4 3.3 Homología 4 3.4 Reconstrucción Filogenética 5 3.4.1 Árboles 5 3.4.2 Tipos de Árboles 6 3.4.2.1 Fenograma 6 3.4.2.2 Cladograma 6 3.4.2.3 Filograma 7 MATERIALES 7 4. DESARROLLO 7 4.1. SELECION DE ESPECIES EN EL SELECIONADOR QUERY DATABANK DE MEGA. 8 4.1.1. ESCHERICHIA COLI 8 4.1.2. PSEUDOMONAS AERUGINOSA 16S rRNA 13 4.1.3. SALMONELLA ENTERICA 16S rRNA 18 4.1.4. BACILLUS CEREUS 16S rRNA 23 4.2. ORDENAR EN EL MEGA LAS ESPECIES 28 4.3. ESQUEMA CON LA FUNCION PHYLOGENY 29 5. CONCLUSIONES 30 CUESTIONARIO 31 2

3. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental INTRODUCCIÓN Las bacterias de los géneros Raoultella y Klebsiella son patógenos oportunistas para los cuales no existe un sistema uniforme de clasificación taxonómica internacional. En el presente estudio se propone una filogenia molecular basada en el gen ribosomal 16S (ADNr 16S) y el gen codificante de la subunidad de la ARN polimerasa (rpoB) de los géneros Klebsiella y Raoultella con el fin de establecer relaciones evolutivas entre dichos géneros. Los resultados evidencian una agrupación acorde con la taxonomía y las características bioquímicas, reportadas en el Genbank. Se estableció una bifurcación en los árboles, lo cual confirma la separación de los géneros Klebsiella y Raoultella. Adicionalmente, se confirmó el carácter polifilético de K. aerogenes por el gen ADNr 16S y la agrupación de R. terrigena y K. oxytoca de acuerdo con el gen rpoB. La comparación entre los árboles obtenidos permitió determinar relaciones evolutivas entre las especies, a partir de los genes evaluados, lo cual refleja cambios aparentes a nivel taxonómico y corrobora la importancia del análisis a nivel de multilocus. Este tipo de estudios permite monitorear la estabilidad de los genotipos microbianos sobre la escala temporal y espacial, mejorar la precisión de las anotaciones taxonómicas (mejor descripción de taxones o subdivisiones genéticas) y evaluar la diversidad genética y adaptabilidad en términos de virulencia. Arenas, N. E., Gutiérrez, A. J., Salazar, L. M., Polanco, J. C., & Gómez, A. (2010). El análisis de secuencias biológicas está fundamentado en los principios de la evolución, las Similitudes y divergencias entre secuencias biológicas relacionadas (reveladas con alineamiento) a menudo requieren ser analizadas y visualizadas en el contexto de árboles filogenéticos por esta razón la filogenética molecular es un área de gran importancia dentro de la bioinformática. (Rodriguez Tello, 2013). 1.OBJETIVOS 1.1.OBJETIVO PRINCIPAL -Conocer los términos asociados al análisis filogenético de moléculas de genes ribomales. 3

4. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 1.2.OBJETIVOS SECUNDARIOS -Aprender el funcionamiento de programas informáticos como el MEGA en el análisis filogenético de moléculas. -Realizar la construcción de un dendrograma de secuencias genéticas. 2.MARCO TEÓRICO 3.1 Filogenética Uno de los paradigmas centrales de la biología es la comparación. A través de comparar a los organismos a distinta escala (desde moléculas hasta rasgos físicos visibles) se les ha podido clasificar en estratos que nos permiten entender la historia evolutiva de la vida misma, desde las bacterias hasta los seres humanos. La filogenética es una rama de la biología evolutiva que se encarga de trazar la relación ancestro descendiente de los organismos a diferentes niveles taxonómicos con base a diversos caracteres homólogos tanto morfológicos como moleculares. Una de las maneras más utilizadas para representar la historia evolutiva de los organismos es a través de una filogenia. Una filogenia describe la historia evolutiva del flujo hereditario a distintos niveles evolutivos/temporales, desde la genealogía de genes en poblaciones (microescala) hasta el árbol universal de la vida(macro-escala). Conogasi. (2015). 3.2 Filogenia La filogenia es la historia de la evolución de un grupo de organismos o, de acuerdo con Colin Tudge, la «genealogía con mayúscula», ya que se ocupa de la relación existente entre especies, familias, órdenes... Para ello, los biólogos se han basado en la morfología, la citología, el registro fósil, etc. La filogenia se puede representar gráficamente mediante árboles filogenéticos. Como su nombre indica, se trata de dibujos con aspecto de árbol. En la base del tronco estaría el antepasado común de todos los organismos, y de él partirían unas ramas, de las cuales saldrían ramas más finas, y de estas ramitas, etc., hasta llegar a las especies actuales, dispuestas en los extremos de las últimas ramificaciones. 3.3 Homología Homología es la relación entre dos caracteres que han descendido, generalmente con modificación, de un ancestro común. Estrictamente se refiere a ancestría común inferida. 4

5. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental Esta homología biológica es una consecuencia de la evolución. Puede haber homología entre órganos de dos especies si dichas estructuras provienen del órgano correspondiente de un antepasado común. El paso de los años puede haber hecho que los órganos actúan Por tanto, para cuantificar el parecido entre un par de secuencias homólogas se dice que presentan globalmente un 70% y 95% de identidad y similitud, respectivamente. (no existe algo cómo 95% de homología). El concepto de homología es simplemente una abstracción sobre la relación entre caracteres, sobre su ascendencia común, relación que es indispensable determinar para poder hacer reconstrucciones filogenéticas que reflejan la historia del “flujo de la herencia”. 3.4 Reconstrucción Filogenética 3.4.1 Árboles Los árboles o dendrogramas son diagramas ramificados que representan las relaciones genealógicas entre las unidades en estudio o unidades taxonómicas operativas (OTUs) o terminales (especies, poblaciones, individuos, o genes). Dependiendo de sus características y usos reciben distintos nombres. Los árboles pueden, o no, presentar una raíz (que representa el ancestro común más antiguo del grupo). El patrón de ramificación se conoce como topología; las ramas o internodos de un árbol pueden girar libremente en los nodos sin afectar la formación de los grupos. Los nodos internos representan a los ancestros comunes hipotéticos. Si la raíz está abajo, el eje vertical es proporcional al tiempo. 5

6. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 3.4.2 Tipos de Árboles 3.4.2.1 Fenograma Cuando el árbol o dendrograma fue construido a partir de una metodología fenética o de distancia se denomina fenograma. Estos árboles tienen la propiedad de ser aditivos (las longitudes de las ramas se suman) y, en algunos casos, pueden también ser ultramétricos (es decir, todas las ramas alcanzan la misma altura). Para los fenogramas, la longitud de ramas es proporcional al grado de semejanza fenotípica o similitud global (ya sea molecular o morfológica) entre las unidades estudiadas. Cuando las ramas tienen distintos largos, dicha medida es una estimación de las distancias evolutivas entre los terminales. 3.4.2.2 Cladograma Cuando el árbol o dendrograma ha sido construido con la metodología cladística, lo denominamos cladograma. Este refleja la jerarquía de grupos hermanos entre los taxones en un diagrama ramificado. Un árbol filogenético combina la información cladística con los rangos estratigráficos de los taxones, reconstruyendo la evolución de los taxones en el tiempo; los nodos están calibrados en el tiempo geológico mediante el registro fósil. 6

7. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 3.4.2.3 Filograma Si el árbol fue obtenido por un método probabilístico lo denominamos Filograma, cuyas ramas llevan implícito el tiempo de divergencia (T) y la tasa de evolución molecular (k), siendo la longitud de las ramas k x T. Así, la longitud de las ramas es proporcional al grado de divergencia filogenética al igual que en los fenogramas con longitud de rama variable. MATERIALES MEGA 3.DESARROLLO En el desarrollo de la presente práctica, elegimos 4 especies del gen 16s. 7

8. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 3.1.SELECION DE ESPECIES EN EL SELECIONADOR QUERY DATABANK DE MEGA. Hemos elegidos 4 especies: 3.1.1.ESCHERICHIA COLI •Escherichia coli strain U 5/41 16S ribosomal RNA, partial sequence 8

9. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •E.coli rrnA gene 9

10. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Escherichia coli H7 gene for 16S rRNA, partial sequence 10

11. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Escherichia coli JCM 20377 gene for 16S rRNA, partial sequence. 11

12. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Escherichia coli JCM 20350 gene for 16S rRNA, partial sequence 12

13. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 3.1.2.PSEUDOMONAS AERUGINOSA 16S rRNA •Pseudomonas aeruginosa strain DSM 50071 16S ribosomal RNA, complete sequence 13

14. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Pseudomonas aeruginosa 57 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 14

15. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Pseudomonas aeruginosa NO6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 15

16. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Pseudomonas aeruginosa CJM 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 16

17. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Pseudomonas aeruginosa partial 16S rRNA gene, strain KSG, Isolate Pseudomonas aeruginosa KSG 17

18. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 3.1.3.SALMONELLA ENTERICA 16S rRNA •Salmonella enterica subsp. arizonae strain ATCC 13314 16S ribosomal RNA, partial sequence 18

19. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Salmonella enterica partial 16S rRNA gene, strain 22/M185/01/98 19

20. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Salmonella enterica gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: NBRC 3163 20

21. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Salmonella enterica gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: NBRC 15335 21

22. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Salmonella enterica strain LGS5 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 22

23. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 3.1.4.BACILLUS CEREUS 16S rRNA •Bacillus cereus ATCC 14579 16S ribosomal RNA (rrnA), partial sequence 23

24. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Bacillus cereus partial 16S rRNA gene, strain ISUWYZ04 • 24

25. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Bacillus cereus partial 16S rRNA gene, isolate BB613 25

26. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Bacillus cereus partial 16S rRNA gene, Isolate BCsd 26

27. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental •Bacillus cereus gene for 16S rRNA, partial sequence, specimen_voucher: GTC:12031 27

28. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 3.2.ORDENAR EN EL MEGA LAS ESPECIES Ahora con la función de La Comparación de Secuencias Múltiples por Log- Expectativa ( MUSCLE ) es un software de computadora para el alineamiento de secuencias múltiples de secuencias de proteínas y nucleótidos. Nos va a dar de las especies un orden por secuencia en la que podemos diferenciar por colores. Luego de ello se elimina los espacios en blancos hasta poder tener una secuencia en orden y sin espacios en blanco por todas las especies. 28

29. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 3.3.ESQUEMA CON LA FUNCION PHYLOGENY Con los datos seleccionados en el Mega tenemos la funcionalidad con phylogeny en la cual nos brinda un esquema según lo deseado, donde clasifica las especies por su gen y/o similitudes. En el trabajo practico nuestro esquema es el siguiente: 29

30. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 5. CONCLUSIONES •El presente trabajo presenta como es la construcción de un árbol filogenetico con la herramienta de MEGAX enla cual este nos ayuda a tener una búsqueda por un banco genético en la cual nosotros utilizamos el gen ribomales 16S rRNA, en el software mediante una herramienta llamada phylogeny nos brinda un esquema de 20 secuencias según elegidas, clasificadas por su gen en donde son 4. 30

31. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental CUESTIONARIO 1.- ¿Qué es el MEGA DNA? MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) es una herramienta utilizada para analizar secuencias evolutivas de ADN y proteínas. La aplicación está disponible como una edición de interfaz GUI y una edición de línea de comandos. MEGA soporta varios formatos de secuencias de ADN y proteínas, incluyendo FASTA, GCG, PIR/NBRF, PHYLIP y Clustal W. La aplicación puede utilizarse para construir alineaciones de secuencias, estimar tiempos de divergencia, inferir historias filogenéticas, diagnosticar mutaciones, estimar tasas de evolución molecular y probar hipótesis evolutivas. La aplicación también viene con tutoriales y archivos de ejemplo para ayudar a los usuarios principiantes. MEGA está diseñado para que los biólogos lo utilicen en la investigación de laboratorio para reconstruir las historias evolutivas de los genes y las especies. Es compatible con varios formatos populares de secuencias de ADN y proteínas, al tiempo que le ofrece herramientas para examinar los datos y realizar una variedad de pruebas. MEGA es una herramienta necesaria para aquellos que realizan investigaciones con secuencias de ADN y proteínas 2.- ¿EN ING. AMBIENTAL PARA QUE NOS SERVIRÁ EL MEGA DNA? El programa MEGA DNA, en ingeniería ambiental nos abre grandes posibilidades gracias a las funciones que ofrece, un ejemplo lo vemos en el ADN ambiental, Ya hace algunos años los ecólogos de todo el mundo comenzaron a estudiar el ADN que, perteneciente a todo tipo de organismos, vaga libremente y puede hallarse a la deriva en el agua de 31

32. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental océanos, ríos o lagos de cualquier rincón del planeta. Conocido como ADN ambiental -ADNe- este material genético presenta un gran potencial para evaluar la distribución de los organismos en todo tipo de ecosistemas acuáticos, y aunque la disciplina aún se enfrenta a numerosos desafíos en el futuro, parece que las aplicaciones cuantitativas del ADN Ambiental comienzan a dar sus primeros frutos. Por otro lado, otra prueba de la buena herramienta que es el MEGA DNA nos lo muestra otro artículo titulado “Científicos estudiarán el ADN ambiental para monitorear el efecto del cambio climático en sitios marinos del Patrimonio Mundial” En la cual podemos resaltar el estudio del ADN ambiental. 3.- ¿EL PROGRAMA MUSCLE, QUÉ FUNCIÓN TIENE? La Comparación de Secuencias Múltiples por Log-Expectativa ( MUSCLE ) es un software de computadora para el alineamiento de secuencias múltiples de secuencias de proteínas y nucleótidos . Se licencia como dominio público . El método fue publicado por Robert C. Edgar en dos artículos en 2004. El algoritmo MUSCLE avanza en tres etapas: el borrador progresivo, el progresivo mejorado y las etapas de refinamiento. En la etapa de borrador progresivo, el algoritmo produce un borrador de alineación múltiple, enfatizando la velocidad sobre la precisión. En la etapa progresiva mejorada, la distancia de Kimura se utiliza para volver a estimar el árbol binario para crear la alineación de borrador, lo que a su vez produce una alineación múltiple más precisa. La etapa de refinamiento final refina la alineación mejorada realizada en el paso dos. Hay varias alineaciones disponibles al final de cada etapa. En las dos primeras etapas del algoritmo, la complejidad temporal es O (N2 L + NL 2), la complejidad espacial es O (N2 + NL + L 2). La etapa de refinamiento agrega a la complejidad del tiempo otro término, O (N3 L). MUSCLE se usa a menudo como un reemplazo de Clustal , ya que generalmente (pero no siempre) da mejores alineaciones de secuencia, dependiendo de las opciones elegidas. Además, MUSCLE es significativamente más rápido que Clustal, más aún para alineaciones más grandes. 32

33. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 4.- EN BASE AL ARTÍCULO: Agrociencia versión On-line ISSN 2521-9766versión impresa ISSN 1405-3195 Agrociencia vol.50 no.2 Texcoco feb./mar. 2016 BIOTECNOLOGÍA Actividad antifúngica e identificación molecular de cepas nativas de Bacillus subtilis Elabore un mapa conceptual de 1 o 2 slides 5. – INDICAR Y CONCEPTUALIZAR CUALES SON LOS GENES QUE SE UTILIZAN EN TAXONOMÍA MOLECULAR, Por ejm, el gen 16S, 23s, entre otros. GEN DESCRIPCIÓN 16S rRNA El ARNr 16S es un polirribonucleótido de aproximadamente 1500 nucleótidos codificado por el gen rrs, también denominado ADN ribosomal 16S. Como cualquier secuencia nucleotídica de cadena sencilla, el ARNr 16S se pliega y adquiere una estructura secundaria que se caracteriza por tener segmentos de doble cadena que permiten la formación de asas y hélices. Esta molécula ha sido reconocida como un poderoso marcador universal debido a que se encuentra en todos los organismos conocidos. Su estructura parece mantenerse por largos periodos de tiempo y, como su función no ha cambiado, los cambios en la secuencia probablemente son aleatorios. En su contraparte eucariota, el ARNr 33

34. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental 18S, las mutaciones son adquiridas lentamente, y es posible obtener información acerca de todos los organismos en una escala evolutiva. Sin embargo, los ARNr poseen suficiente variabilidad para diferenciar no sólo los organismos más alejados, sino también los más próximos, y es posible diferenciar especies, cepas o variedades. Además, el tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1500 nucleótidos) minimiza las fluctuaciones estadísticas, y la conservación de su estructura secundaria favorece el alineamiento preciso durante la comparación de secuencias (Rodicio, Mendoza, 2004). 23S rDNA Es un gen de aproximadamente 3,000 nucleótidos de longitud que se localiza en la subunidad grande de los ribosomas en procariotas. Este gen presenta inserciones y deleciones más grandes que el gen 16S rRNA. Las inserciones estables y deleciones de algunas bases en el gen 23S rDNA son características comunes en algunas clases y subclases de bacterias. Estos cambios complican los análisis, ya que las diferentes posiciones no pueden considerarse para realizar clasificaciones filogenéticas correctas (22). El gen 23S rDNA se ha utilizado en conjunto con el 16S rRNA para la clasificación taxonómica de bacterias no cultivables. Además, se ha utilizado el espaciador intergénico (ITS) localizado en la región 16S-23S, la cual es una región muy variable para diferenciar entre dos cepas pertenecientes a la misma subespecie 5S rDNA Es un gen de aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, se encuentra prácticamente en todos los ribosomas con excepción de los mitocondriales, de algunos hongos, de animales superiores y de la mayoría de las protistas. Aunque la secuencia de este gen está altamente conservada, la fiabilidad de este gen como marcador está cuestionada debido a que su longitud es muy pequeña y por lo tanto no ofrece la suficiente resolución para contribuir significativamente a comprender relaciones filogenéticas entre taxones 18S ARNr Es la macromolécula equivalente. Dado que los ARNr 16S y 18S proceden de las subunidades pequeñas de los ribosomas, el acrónimo ARNr SSU (del inglés, small subunit) se utiliza para ambos. Los ARNr SSU se encuentran altamente conservados, presentando regiones comunes a todos los organismos, pero contienen además variaciones que se concentran en zonas específicas. 34