PRACTICA N2 INFORME DE LABORATORIO - CULTIVO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA PRACTICA N°2 CULTIVO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERES BIOTECNOLOGICO Integrantes: Arévalo Navarro, Stefani Brilly Dueñas Rodríguez, Adriana Melody Luna Merma, Mayra Alexandra Ticona Vilca, Siory Estefany Docente: Dr. Hebert Hernán Soto Gonzales Ilo, Moquegua, Perú 2022

2. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental PRACTICA N°2: CULTIVO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO Biotecnología Asesor: Dr. Hebert Hernán Soto Gonzales Responsables: Arevalo Navarro, Stefani Brilly Luna Merma, Mayra Alexandra Ticona Vilca, Siory Estefany Dueñas Rodriguez, Adriana Melody VII Ciclo Ilo, Moquegua, Perú 2022

3. ÍNDICE INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 4 OBJETIVOS .................................................................................................................... 5 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................ 5 OBJETIVO ESPECÍFICO ............................................................................................ 5 MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 6 MATERIALES ............................................................................................................. 6 EQUIPOS ..................................................................................................................... 6 ELABORACIÓN DE AGARES Y CALDOS PARA EL CULTIVO DE BACTERIAS ...................................................................................................................................... 8 INOCULACIÓN DE MUESTRAS EN PLACAS PETRI CON AGAR NUTRITIVO (05-05-2022) ................................................................................................................. 8 CONTEO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS (09-05-2022) ................................. 9 PROCEDIMIENTO ...................................................................................................... 9 DATOS Y OBSERVACIONES...................................................................................... 10 NORMAS DE SEGURIDAD ..................................................................................... 10 DATOS ...................................................................................................................... 11 DISCUSIONES .......................................................................................................... 12 CONCLUSIONES .......................................................................................................... 16 ANEXOS ....................................................................................................................... 17 TABLA DE ILUSTRACIONES Figura 1Materiales de vidrio .......................................................................................... 17 Figura 2 Pesado de Caldo nutriente ................................................................................ 17 Figura 3 Conteo de colonias en placas inoculadas .......................................................... 18 Figura 4 Presencia de UFC en muestra de suelo ............................................................. 18 Figura 5 Colonias formadas en tres de ocho placas Petri ................................................ 18 Figura 6 Aislamiento de colonias en nueva placa Petri con cultivo ................................. 18

4. INTRODUCCIÓN Los microorganismos son organismos ubicuos y en los ambientes naturales se encuentran usualmente como poblaciones mixtas, por lo que es necesario tenerlos como cultivos puros por medio de aislamientos, para así poder identificarlos y caracterizarlos. La preparación de un cultivo puro implica no solo el aislamiento de un determinado microorganismo, sino su mantenimiento y el de su descendencia. Es importante determinar los diferentes medios de cultivo y condiciones de incubación óptimas para cada uno de ellos y así lograr la formación de colonias visibles aisladas. La aislación es la separación de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le acompañan. El método más usual es la siembra por estría sobre un método de cultivo sólido dispuesto en una placa de Petri. Es posible utilizar diferentes estrategias para el aislamiento e identificación de microorganismos: Separación física mediante diluciones seriadas y siembra en; utilización de medios de cultivos selectivos y diferenciales y aprovechamiento de características particulares de los microorganismos. Para facilitar y mejorar el proceso generalmente se combinan estas estrategias. En nuestro caso utilizamos muestras provenientes de diferentes suelos, el algarrobal, el río del algarrobal, Moquegua y río Osmore. El suelo está constituido por minerales de varios tamaños, formas y características químicas, raíces de plantas, población de organismos vivos (microorganismos) y materia orgánica en varias etapas de descomposición. Cada factor físico y químico del suelo influye en el crecimiento o actividad de los microorganismos. El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno con condiciones apropiadas. Los microorganismos en proliferación producen réplicas de sí mismos y necesitan los elementos presentes en su composición química. Los nutrientes deben proporcionar estos elementos en una forma que sea accesible desde el punto de vista metabólico. Además, los microorganismos requieren energía metabólica para sintetizar macromoléculas y mantener gradientes químicos esenciales a través de sus membranas. Los factores que deben controlarse durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura, aireación, concentración de sales y fuerza iónica del medio.

5. Para que se cultiven con éxito, las bacterias requieren la provisión de nutrientes en el medio de cultivo. Hay muchas formulaciones diferentes disponibles para satisfacer las diferentes necesidades nutricionales de las especies bacterianas. El tipo de medio la elección dependerá del propósito del cultivo. Rico, nutritivo o medios completos puede ser útil cuando se intenta aumentar el volumen de un cultivo puro y mantener las células bacterianas en buenas condiciones. medios mínimos por otro lado, proporcionará sólo las necesidades básicas para la supervivencia y puede ser útil para manipular qué vías se activan en la bacteria. El caldo de cultivo en medio líquido, también conocido como cultivo en caldo, proporciona a las bacterias presentes un fácil acceso a los nutrientes disponibles en comparación con las colonias bacterianas estáticas. El agar nutritivo a los medios líquidos permite colocarlos en placas de Petri, como pendientes o en tapones, los medios selectos promueven o inhiben el crecimiento de ciertas especies, grupos de especies o cepas con propiedades particulares. Esto puede basarse en la capacidad de una cepa para utilizar nutrientes específicos, producir ciertos subproductos o resistencia a ciertos antibióticos. Se puede utilizar la selección tanto en caldo como en medios sólidos. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL -Desarrollar las principales técnicas de aislamiento, selección, conservación, mantenimiento de cepas microbianas de importancia biotecnológica, manejo de equipos de laboratorio y preparación de medio de cultivo. OBJETIVO ESPECÍFICO -Inicio del punto de partida de los proyectos biotecnológicos encargados a cada grupo. -Fomentar el trabajo en equipo para facilitar el cumplimiento de objetivos de los proyectos, por lo que incrementara la motivación y la creatividad, favoreciendo las habilidades de cada integrante. -Motivar al estudiante en temas de investigación aplicada a la biotecnología ambiental. -Conocer la infraestructura de los laboratorios de la EPIAM asociados a los principios de las buenas prácticas de laboratorio (BPL) con responsabilidad.

6. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES -Medios de cultivo (Agar Nutriente y Caldo Nutriente) -25 placas Petri -12 tubos de ensayo -Vaso precipitado de 100 mL y 600 mL -Frasco de vidrio de 1000 mL -2 pipetas de 10 ml -Matraz Erlenmeyer -Embudo de decantación -Probeta -Agua filtrada Tipo-II libre de sales -250 mondadientes -Papel Kraft -Cinta -Bolsas zip -Pabilo -Papel aluminio -Muestras de suelo EQUIPOS -Autoclave -Balanza analítica -Agitador magnético -Contador de colonias -Cámara de flujo laminar

7. AUTOCLAVE BALACE ANALÍTICA CONTADOR DE COLONIAS CÁMARA DE FLUJO LAMINAR AGRITADOR MAGNETICO

8. ELABORACIÓN DE AGARES Y CALDOS PARA EL CULTIVO DE BACTERIAS -Colocar los tubos de ensayo en el vaso precipitado de 600 mL (12A) y los 250 mondadientes en el vaso precipitado de 100 ml -Colocar 250 ml de agua en el matraz de 500 ml (4A) y tapar con un tampón. -Forrar todos los materiales con papel aluminio y papel Kraft, sujetarlos con pabilo. -Rotular todos los materiales a utilizar. -Encender la autoclave y colocar los materiales en la cámara de la autoclave y tapar, dejar por 15 min hasta que llegue a los 121°C. -Pesar 3.25 gr. de caldo nutritivo y 10 gr. de Agar nutriente. -Colocar los 10 gr. de Agar nutriente en el vaso precipitado de 1000 ml y agregar 400 ml de agua destilada, llevar esta solución al agitar a 25°C a 400 rpm. -Vaciar la solución de Agar nutriente en la probeta y agregar 100 ml de agua destilada. -Colocar esta solución preparada en un frasco y tapar con papel aluminio. -Colocar los 3.25 gr. de Caldo nutriente en el vaso precipitado de 1000 ml y agregar 200 ml de agua destilada, colocar el magneto y llevar esta solución al agitar a 25°C a 400 rpm. -Vaciar la solución de Agar nutriente en la probeta y agregar 50 ml de agua destilada. -Colocar esta solución preparada en un frasco y tapar con papel aluminio. -Llevar los materiales a la estufa a una temperatura determinada. INOCULACIÓN DE MUESTRAS EN PLACAS PETRI CON AGAR NUTRITIVO (05-05-2022) -Retirar los materiales autoclavados un día anterior de la estufa a una temperatura determinada. -Llevar la botella con 500 ml Agar Nutritivo hacía la cámara de flujo laminar, donde se trabajará con un mechero Bunsen para mantener el contorno ambientado y evitar la contaminación de los materiales. Para el trabajo en la cámara de flujo laminar, es necesario antes desinfectarse las manos con alcohol al 70% para evitar la contaminación de lo trabajado. -Llenar las placas Petri con Agar Nutritivo, lo suficiente para que llene toda la placa Petri y no haya burbujas existentes. Posteriormente, dejamos solidificar el agar nutritivo a temperatura ambiente, puesto a que, al no ser un caldo, este tenderá a solidificarse sin necesidad de un proceso o tratamiento previo.

9. -Una vez solidificadas las muestras, mezclamos dos gramos de muestra de suelo junto a 250 ml de agua destilada para comenzar la inoculación de la muestra. -Rotulamos los tubos de ensayo con: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 y -8 para identificar el grado de dilución de la muestra. CONTEO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS (09-05-2022) PROCEDIMIENTO -Sacar las placas Petri del incubador para observar el crecimiento de las bacterias inoculadas tres días anteriores a ese. -Conteo de bacterias mediante el equipo especializado para el conteo de colonias. Anexo 1 -Se descartarán las placas cuyas bacterias no se han formado, dejando así las placas cuyas colonias están presentes para empezar a trabajar con estas. Anexo 2 -Con las placas seleccionadas, llevarlas a la cámara de flujo laminar para posteriormente aislar las bacterias en una zona esterilizada. Anexo 3 -Retiramos los mondadientes del vaso precipitado 100 ml previamente esterilizados por medio de la autoclave. Esta acción se realizará dentro de la cámara de flujo laminar para evitar futura contaminación con respecto a los cultivos. -Aislamos las colonias de bacterias cuyas estén más separadas para evitar el contacto entre colonias y procedemos a trasladar dicha colonia a una nueva placa Petri con Agar Nutriente. Anexo 4 -Llevaremos las nuevas placas Petri al incubador para observar el nuevo crecimiento de las colonias seleccionadas de las cuatro zonas seleccionadas.

10. DATOS Y OBSERVACIONES NORMAS DE SEGURIDAD 1.Usar siempre mandil blanco de algodón debidamente cerrado. 2.No ingerir alimentos en el laboratorio. 3.Identificar y conocer la ubicación de los elementos de seguridad del laboratorio, tales como extintor, botiquín, salida de emergencia, lavaojos, duchas de seguridad, alarmas, etc. 4.El Acceso al laboratorio estará limitado, de acuerdo con el aforo del ambiente y sólo para el grupo de estudiantes inscritos en el curso o clase. 5.Es imprescindible mantener el orden y la limpieza del área de trabajo. 6.Después de las experiencias en laboratorio, se debe lavar cuidadosamente las manos 7.No inhalar, probar u oler productos químicos. 8.Leer, entender y no alterar las etiquetas de los envases. 9.En caso de derramar Líquidos en la mesa o suelo avisar inmediatamente al docente, considerando las características fisicoquímicas del Líquido. 10.No se debe bromear en el laboratorio, esta actitud puede generar grandes accidentes. 11.No utilizar equipos o elementos químicos sin haber recibido, previamente, una capacitación de sus características, 12.No se debe pipetear con la boca, utilizar una bombilla de succión. 13.En caso de experimentar con vapores o gases se realizarán bajo la Campana de seguridad para extracción de gases. 14.Cuando se hagan experiencias con materiales inflamables (con punto de ebullición inferior a 61°C) se debe designar a responsables en el uso de extintores. 15.Está prohibido verter los líquidos corrosivos o alcalinos en los desagües. 16.El material de vidrio roto no se debe disponer en el basurero común, envolverlo y ubicarlo en los recipientes para tal fin. 17.El alumno estará obligado a utilizar los Equipos de Protección Personal (EPP) y seguir al pie de la letra las indicaciones dadas por el profesor acerca de cómo preparar reactivos y cómo llevar a cabo la práctica.

11. DATOS En el trabajo práctico, luego del procedimiento de preparación de cultivo, esperamos que estén se reproduzcan: para nuestros resultados fueron: RIO ALGARROBAL Y RÍO OSMORE TOMA UNIDAD OBSERVACION ES FOTO FORMADORA DE COLONIAS -1 4 Una bacteria con mayor proporción (expansora) -2 2 Colonias pequeñas -3 - -4 - -5 - -6 - -7 501 Variedades colonias diferentes tamaños. de de -8 -

12. TIERRA DE MOQUEGUA Y EL ALGARROBAL TOMA UNIDAD OBSERVACION ES FOTO FORMADORA DE COLONIAS -1 204 Variedad colonias de -2 9 Colonias pequeñas -3 8 Colonias diferentes tamaños de -4 - -5 - -6 - -7 - -8 - DISCUSIONES ●En el primer grupo con muestreos de río del algarrobal y el río Osmore, realizamos los pasos correspondientes para el cultivo y aislamiento de microorganismos, el resultado pudimos observar que a las submuestras del -1 al -8, las dos primeras y la séptimo se obtuvo el crecimiento de microorganismos en el cultivo, específicamente:

13. ○En la primera toma se encontró 4 bacterias con colonias muy grandes, se mostraban como una gran mancha con tonalidades blancas a cremas. ○En la segunda toma se encontró dos colinas con proporciones pequeñas se visualizaba como pequeñas manchas y puntitos diminutos.

14. ○En la séptima toma se encontró gran proporción de colonia, específicamente se encontró 501 microorganismos, de forma de manchas blanquecinas, con separación, esta muestra de cultivo es irregular con las anteriores muestras, por lo que suponemos que puede ser por diferentes factores, como la concentración del cultivo tenga más nutrientes, o posiblemente una contaminación externa, al igual un microorganismo con características de sobrepoblación. ●En el segundo grupo con muestreos en tierras con ubicación de Moquegua y el Algarrobal, realizamos los pasos correspondientes para el cultivo y aislamiento de microorganismos, el resultado pudimos observar que a las submuestras del -1 al -3, las tres primeras por continuidad de procedimiento se obtuvo el crecimiento de microorganismos en el cultivo, específicamente: ○En la primera submuestra, encontramos 204 de variedad de colonias en ellas, detallamos que por ser la primera submuestra consideramos que en ella debe mayor crecimiento que en las posteriores.

15. ○En la segunda submuestra se hallaron 9 colonias pequeñas, con manchas de proporción diferente a las vecinas, unas más grandes que otras. ○En la tercera submuestra se encontró 8 colonias de diferentes tamaños, de colores blanquecinos, consideramos que este procedimiento cumple con los posibles resultados, es decir por la toma de muestra esta es de menor resultado en comparación de las primeras muestras. ●El procedimiento fue según lo esperado, en la segunda muestra se obtuvo resultados consecutivos al muestreo, es decir en la primera hay mayor proporción de colonias y van disminuyendo al pasar las submuestras, sin embargo en nuestros resultados de la primera muestra ubicados en los ríos del algarrobal y Osmore, específicamente en la séptima submuestras se encontró 501 colonias, que no va seguido a los pasos correspondientes, por lo que podemos deducir de un microorganismos con diferentes características en su cultivo o posiblemente de una contaminación exterior.

16. CONCLUSIONES ●Se logró conocer e identificar con éxito la diferente infraestructura de los laboratorios de la EPIAM, los cuales tienen los equipos necesarios para desarrollar de manera confiable las prácticas. ●El aislamiento, selección, conservación y mantenimiento de cepas microbianas se desarrolló de manera correcta con la ayuda del buen manejo de los equipos de laboratorio y preparación del medio de cultivo ●Se logró desarrollar el punto de partida de nuestro proyecto denominado “DESARROLLO DE UN BIOINSECTICIDA PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE SIMULIDOS HEMATOFAGOS Simulium escomeli EN LA PROVINCIA DE ILO” en el cual necesitábamos el cultivo y aislamiento de bacterias

17. ANEXOS Figura 1Materiales de vidrio Figura 2 Pesado de Caldo nutriente

18. Figura 4 Presencia de UFC en muestra de suelo Figura 3 Conteo de colonias en placas inoculadas Figura 6 Aislamiento de colonias en nueva placa Petri con cultivo Figura 5 Colonias formadas en tres de ocho placas Petri