E N D
1. Production d’anticorpspolyclonaux Vaccination
2. Principe Un antigène
Un animal
Une immunisation
Un immun sérum
Des anticorps polyclonaux
3. Antigénicité Antigène
L'antigène est défini comme une substance qui réagit spécifiquement avec des anticorps ou des récepteurs cellulaires et qui est capable de stimuler une production d'anticorps ou une réaction cellulaire spécifique.
4. Immunogénicité Haptènes
Ce sont aussi des molécules qui sont capable de réagir spécifiquement avec l'anticorps, mais qui ne peuvent pas à elles seules provoquer la production d'anticorps par les cellules spécifiques. L'haptène peut devenir immunogène lorsque que ce dernier est couplé à un porteur ou carrier
5. Haptènes Composés non immunogènes
médicaments, composés organiques, peptides, oligosaccharides
MW compris entre 2 et 5 kDa
Conjugaison avec un porteur
Antigène multivalent
immunogène
Anticorps anti-haptène
Porteur non présent chez l ’hôte
Deux porteurs différents en fonction des applications
6. Les porteurs Sérum Albumine Bovine (SAB)
50% des protéines du sérum
Porteur le plus utilisé pour immunisation chez la chèvre et le mouton.
MW 66 kDa
7. Les porteurs Keyhole limpet hemocyanin (KLH)
Protéine de la respiration chez les mollusques.
Très immunogène, nombreuses lysines, (-NH2)
Limitation des réactions croisées
Polymère
MW 8-9 x 106 Da
8. Les porteurs Thyroglobuline
Tétramère
Glycoprotéine, précurseur des hormones thyroïdiennes
Extrait de la glande thyroïde
Très immunogène
Absent du sérum, limitation des réactions croisées
Conjugaison avec les amines
MW 670 kDa
9. Les agents couplant Sulfo SMCC
Hétéro bifonctionnel
Réagit avec NH2 sur la protéine et SH sur l ’haptène
Eliminé après la conjugaison
10. Les agents couplant Maléiimides
11. Anticorps Est défini comme anticorps toute substance dont la production est provoquée par l'administration d'antigènes ou d'haptènes couplés à un porteur.
Il s’agit toujours d’une immunoglobuline
12. Immunoglobuline
14. Production d’anticorps Immunisation
Animal
Dose
Adjuvant
Méthode
Purification
Précipitation
Chromatographie
Autres
15. Animaux Lapin, souris, rat, cochon d’inde, hamsters
Lapin le plus utilisé pour la production d’anticorps polyclonaux
Facile à porter
Propre
Peuvent être prélevés fréquemment
Bon producteurs, volume de sérum important
Souris, rat, cochon d’inde, hamsters
Production d’anticorps monoclonaux
Génétiquement éloigné de l’origine de l’immunogène
19. Dose Faibles de l’ordre du mg.
L’antigène est purifié
L’antigène est en solution dans du tampon avec un adjuvant
Site d’inoculation dépend
Du volume à injecter
La vitesse de libération
La solution de solubilisation
21. Adjuvant Substances qui intensifient la réponse immunitaire de plusieurs manières :
Protection de l’antigène d’un catabolisme précoce
Émulsion eau dans l’huile ou huile dans l’eau
Concentration de l’antigène, libération lente de l’antigène
Particules de silice, sels d’aluminium, latex etc…
Stimulation de la production d’interleukine, inflammation
Parois de bactéries, peptidoglycanes de synthèse
24. Quelques adjuvants Montanide ISA Adjuvants [Seppic, Paris, France]
Surfactants dans de l’huile non métabolisable
Ribi's Adjuvants (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT)
Détergents, squalène, bactéies modifiées.
Hunter's TiterMax (CytRx Corp., Norcross, GA)
Surfactants dans de l’huile non métabolisable
Gerbu Adjuvant [Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Germany/C-C Biotech, Poway, CA
Aqueux, immunostimulateurs
25. Inoculation Sous cutanée
Lapin
Plusieurs sites possible
800 µl
Intramusculaire
Libération lente de l’ag
Pas adapté pour les petits animaux
Intradermique
Libération très lente de l’ag
Petits volumes, l’antigène doit être concentré
Utilisé pour les gros animaux
26. Inoculation Intraveineuse
Exposition rapide de l’antigène aux cellules immunocompétentes
Dangeureuse, effets secondaires, choc anaphylactique
Intrapéritonéale
Souris et petits animaux
500 µl
Directement dans les organes lymphoïdes
Difficile à réaliser
Souvent létale
27. Prélèvement Prélever dans la veine marginale
Veine de la queue (souris)
28. Cinétique de production d’un immun sérum
29. Réponse immunitaire
30. Réponse primaire Phase de la latence
Activation du système immunitaire
Croissance exponentielle
Production des anticorps
IgM, puis IgG
Décroissance
Régulation de la réponse immunitaire
34. Réponse secondaire Pas de phase de latence
Intensité plus forte
Durée plus longue
38. Purification Élimination des protéines non immunologique
Méthodes physico-chimique
Centrifugation/filtration
Précipitation par les sels neutres
Chromatographie
Affinité de groupe, protéine A ou protéine G
Affinité spécifique, l’antigène
39. Électrophorèse du sérum
40. Centrifugation/Filtration Élimination des débris cellulaires : centrifugation
Petits volumes 10 000 g pendant 15 min
Lysats cellulaires 40 000 à 50 000 g pendant 30 min
Élimination des petites particules : filtration
Membrane de PVDF porosité de 0,22 à 1 µm
41. Lipoproteines Colmatage des colonnes de chromatographie
Parfois présente en fortes concentrations :
Liquides d’ascite
Précipitation
en présence de sulfate de Dextran
En présence de polyvinylpyrrolidine (PVP) à pH 7.0
Élimination du précipité par centrifugation
42. Précipitation
43. Agents précipitants
44. Dessalage
45. Chromatographie
46. Chromatographie d’affinité
47. Colonnes de chromatographie
48. Chromatographie d’affinité de groupe Protéine A
Extraite de staphylocoque aureus
Protéine G
Extraite du streptocoque du groupe G
Liaison avec le fragment Fc de l’immunoglobuline
51. Chromatographie d’affinité, références internet Tutorial animé illustrant la chromatographie d’affinté
http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LC-tech+Affinity+Chromatography
Cours sur la chromatographie
http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep+Education+Centre
Handbook
Chromatographie d’affinité
Purification d’anticorps