Transmission d information g n tique

1. Transmission d�information g�n�tique La Transmission horizontale : Elle est unidirectionnelle et passe souvent par la recombinaison homologue. Les 3 moyens d'�change g�n�tique pratiqu�s par les procaryotes (transformation, conjugaison et transduction) font appel � la recombinaison homologue. La recombinaison homologue chez les eucaryotes se manifeste principalement au cours d�une division particuli�re, la m�iose, chez les bact�ries celle-ci peut avoir lieu tout le long du cycle cellulaire. La compr�hension de la recombinaison homologue est essentiellement bas�e sur les travaux effectu�s chez E. coli.

2. La Recombinaison homologue La recombinaison g�n�tique est le concept de base utilis� pour la localisation de mutations (et par extension de g�nes). Cassure et jonction de nouvelles s�quences sont en partie responsables de la diversit� g�n�tique observ�e chez les procaryotes. Ex. : A--B et a--b donne A--b et a--B apr�s recombinaison. La recombinaison homologue s�effectue entre s�quences d�ADN identiques ou quasi identiques dont la longueur d�homologie chez E. coli peut �tre aussi courte qu�une 30aine de pb. Elle requiert la mobilisation de produits de nombreux g�nes pour r�soudre ce que vous connaissez sous le terme de crossing-over.

3. La Recombinaison homologue, les �tapes� Cassure d�ADN Recherche d�homologie et initiation d�appariement, �tape cl� g�r�e par le produit du g�ne recA Mod�le des jonctions de Holliday Migration des jonctions de Holliday, extension de la zone de recombinaison R�solution Les intervenants prot�iques sont extr�mement nombreux � chaque �tape et c�est la coordination de tous les �v�nements qui aboutit � l��change g�n�tique. Les m�canismes de recombinaison homologue sont � la fois responsables du maintien de l�information g�n�tique (outils de r�paration) et sources de variation de l�information.

4. Mod�le de recombinaison homologueIllustration: KowalczykowskiTIBS 25 april 2000, p156

5. La Transformation Processus permettant la capture d�ADN exog�ne nu par une bact�rie et son incorporation au g�nome de celle-ci.

6. La transformation : ex, le pneumocoque La bact�rie Streptococcus pneumoniae : Diplocoque � Gram positif Niche: Nasopharynx chez l'homme, 1 individu sur 2 est porteur sain Pathog�ne, provoque principalement des pneumonies, des otites, m�ningites... Repr�sente aux USA environ 500000 hospitalisations et 40000 d�c�s, en France environ 10000 d�c�s. 1�re cause de mortalit� par infection chez l�enfant, 1�re cause de m�ningite et de surdit� acquise chez l�enfant� Cibles privil�gi�es : enfants, personnes ag�es et individus ayant leur syst�me immunitaire affaibli (un fumeur aurait un risque augment� d'un facteur 4)

7. La transformation : ex, le pneumocoque Particularit�s : Poss�de une capsule polysacharidique le prot�geant du syst�me immunitaire avec une variabilit� importante, environ 90 s�rotypes r�pertori�s. Capable de capturer de l'information g�n�tique exog�ne via un syst�me g�n�tique programm� qu'est la Transformation g�n�tique naturelle. De ce fait, cette bact�rie poss�de une grande plasticit� g�n�tique. La transformation est � la base de l'�mergeance rapide de clones r�sistants aux antibiotiques

8. �tapes de la transformation

9. �tapes de la transformation

10. Entr�e de L�ADN, aspect M�canistique

11. Approche exp�rimentale Comment la bact�rie s�approprie-t-elle l�information exog�ne? Y a-t-il �change physique par recombinaison homologue ou bien l'information est-elle recopi�e sur le g�nome sans incorporation de la mol�cule exog�ne? Vincent M�jean and Jean Pierre Claverys; J. Bacteriol. 1984; Vol 158; N�3; 1175-1178 Mise en Place de l'exp�rimentation - plasmide pR6 d'E. coli contenant un fragment d'ADN PstI/EcoRI chromosomique de Sp de 5.7 kpb.

12. Suivi du devenir de l�ADN :strat�gie exp�rimentale

13. Vincent M�jean and Jean Pierre Claverys; J. Bacteriol. 1984; Vol 158; N�3; 1175-1178 Profil de radioactivit� apr�s Southern

14. Devenir de l�ADN internalis�

15. Suivi de l�ADN

16. Suivi du devenir de l�ADN :strat�gie exp�rimentale

17. Sous quelle forme l�ADN entre dans la bact�rie ?

18. Polarit� d�entr�e Existe-t-il une polarit� d'entr�e de l'ADN simple brin, comment l'observer ? Vincent M�jean and Jean Pierre Claverys Mol. Gen. Genet. 1988; 213, 444-448 Exp�rimentation Utilisation du bact�riophage M13, polym�rase, dNTP radioactifs et froids, enzyme de restriction et purification des mol�cules d�sir�es. Obtention de diff�rents substrats�

19. Polarit� d�entr�e

20. Recombinaison RecA d�pendante Martin,B.; Ruellan,J.M.; Angulo,J.F.; Devoret,R.; Claverys,J.P. 1992 Nucl.Acids Res. 20 6412 Martin,B.; Garcia,P.; Castani�,M.P.; Claverys,J.P.1995 Mol.Microbiol.15 367-379 Question: par quel m�canisme cet ADN simple brin est-il recombin� dans le g�nome? Est-ce qu'il existe un syst�me de recombinaison homologue recA d�pendant similaire � celui de E.coli? � Mise en place de la recherche d'un �quivalent de RecA d'E.coli. Isolement d'un g�ne homologue par recherche anticorps crois�e. Quel est le comportement d'un mutant recA nul en transformation? Ne transforme pas

21. Recombinaison RecA d�pendante Question: ne rentre pas ou bien ne recombine pas? Exp�rimentation: ADN donneur radioactif + cellule comp�tente en parall�le sur wt et recA R�sultats interpr�tations: Mesure de l'entr�e en radioactivit� Dpm/bact�ries 3.3 10-4 pour wt et 3.5 10-4 pour recA Mesure du taux de transformants Smr chromosomique 1.8 106/ml (3%) et <10/ml pour recA Dans le mutant recA, l'ADN entre comme dans le wt, recA est donc impliqu� dans la derni�re partie de la transformation, la recombinaison homologue.

22. La conjugaison Une remarquable propri�t� de bien des plasmides est de poss�der l�information g�n�tique leur permettant de se transf�rer d�une cellule � l�autre : c�est la conjugaison. Observ�e pour la 1�re fois en 1947 par Lederberg et Tatum chez E. coli. La conjugaison est un m�canisme unidirectionnel avec une bact�rie donneuse et une bact�rie r�ceptrice. Parfois les plasmides conjugatifs participent � la mobilisation du chromosome ou d�autres plasmides. Les plasmides conjugatifs peuvent �tre class�s selon leur mode de r�plication (groupe d�incompatibilit�) et aussi selon leur m�canisme de transfert (g�nes tra). Beaucoup de plasmides dits ��� large spectre d�h�te�� sont capables d��tablir des transferts inter-esp�ces mais aussi inter-royaumes.

23. M�canisme de conjugaison Cf petit film 2 �tapes importantes�: r�plication de l�information et transport de l�ADN. Contact cell-cell : ensemble de prot�ines constituant un syst�me de s�cr�tion de type IV chez les Gram- formant un canal trans-membranaire. Le complexe ADN-prot�ine charg� de la r�plication : Cassure simple brin au niveau d�oriT (diff�rent de oriP) D�placement par une h�licase du brin cass� Passage dans la cellule r�ceptrice et recircularisation du brin Synth�se des brins compl�mentaires.

24. Transfert du chromosome par conjugaison Cf petit film Formation d�Hfr ( l�insertion du facteur F : recombinaison homologue entre IS et formation de coint�grat via des �v�nements de transposition). Un chromosome peut �tre aussi mobilis� si celui-ci poss�de une oriT. Facteur prime�: insertion d�ADN chromosomique dans le plasmide conjugatif (ex�: � partir d�un Hfr, une recombinaison homologue peut avoir lieu entre 2 IS r�p�t�es directement entourant l�insertion du F, donnant ainsi un F�) Ces �v�nements jouent un r�le certain dans l��volution puisque des g�nes peuvent �tre �chang�s entre esp�ces �loign�es� Historique�: E. coli Les outils�g�n�tiques d�riv�s du m�canisme�: La cartographie g�nome circulaire� Le Mating out

25. D�termination g�n�tique de la transmissibilit� d�un plasmide Pour observer un transfert il faut �liminer les donatrices et les r�ceptrices pour ne conserver que les r�ceptrices ayant re�ues le plasmide. Contre-s�lection de la r�ceptrice : il faut que le plasmide poss�de un marqueur de s�lection que n�a pas la r�ceptrice. Si le Plasmide ne poss�de pas un g�ne s�lectionnable, il faut en introduire un. Contre-s�lection de la donatrice�: il faut que la r�ceptrice poss�de un marqueur de s�lection que n�a pas la donatrice (ex: une r�sistance chromosomique). Choix de la cellule r�ceptrice crucial�: proche de la donatrice pour �viter des probl�mes de restriction, de r�plication du plasmide et d�expression du g�ne de s�lection. La manipulation consiste � �taler la donatrice, le m�lange, et la r�ceptrice, seul le m�lange devrait donner des colonies sur milieu double s�lection.

26. La conjugaison chez Enterococcus faecalis : un exemple de communication bact�rienne G. Dunny M Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides 22 1529-1539 � Cela fait bient�t 30 ans que l�on a isol� le plasmide conjugatif pCF10 conf�rant la r�sistance � la t�tracycline chez E. faecalis. Isol� � partir d�une infection nosocomiale, il a �t� � nouveau isol� du m�me h�pital mais cette fois avec une r�sistance � la vancomycine, un des derniers antibiotiques rempart contre les bact�ries pathog�nes ou opportunistes. Cela signifie que ce plasmide a voyag� parmi les ent�rocoques acqu�rant diff�rents Transposons responsables de ces nouvelles r�sistances.

27. La conjugaison chez Enterococcus faecalis : un exemple de communication bact�rienne G. Dunny M Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides 22 1529-1539

28. Comment la cellule r�prime l�induction de cCF10 ?G. Dunny M Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides 22 1529-1539

29. Synth�se de la ph�romone cCF10 G. Dunny M Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides 22 1529-1539

30. Conjugaison chez les Streptomyces

31. Transposon conjugatif ou ICEBurrus, Pavolovic, Decaris et Gu�don molecular Microbiol. 2002 vol 46 p601-610 Hybride entre les transposons � recombinaison sp�cifique de site et plasmide conjugatif d�pourvu d�oriP. Le plus connu est Tn916 isol� aussi chez E. faecalis. Ces �l�ments sont actuellement r�pertori�s et semblent tr�s r�pandus dans le monde bact�riens. Appel�s ICEs pour Integrative and Conjugative Elements. La tr�s grande majorit� d�entre eux font tous appel � un syst�me de recombinaison site sp�cifique pour leur int�gration. Note: pCF10 doit sa r�sistance � la t�tracycline par l�int�gration de Tn925 qui est un ICE dans le plasmide conjugatif d�origine..

32. Le monde des bact�riophages

33. Le monde des bact�riophagesEx�: N. Mann, FEMS Microbiology review 27 (2003) p17 La place des bact�riophages dans le monde vivant est � prendre en compte. Les cyanobact�ries comme Synechococcus et Prochlorococcus sont responsables de 32 � 89% de l�apport oligotrophique dans les oc�ans et de 50% de l�oxyg�ne que l�on respire. Ces bact�ries sont pr�sentes en moyenne � 106/ ml d�eau de mer. Cependant on estime que les bact�riophages sont 10 x plus nombreux. Au cours de l�ann�e la r�partition des cyanobact�ries dans une r�gion, tant en profondeur qu�en quantit�, varie �norm�ment et semble corr�l�e � la multiplication de certains bact�riophages. Ceux-ci poss�dent en plus de leur information g�n�tique des g�nes participent � la photosynth�se, pouvant ainsi influencer la survie de la population bact�rienne�

34. Les cycles

35. La transduction

36. La transduction La transduction est un ph�nom�ne rare et cela pour plusieurs raisons�: l�erreur d�empaquetage dans la capside est un �v�nement peu fr�quent. La probabilit� que cette particule infecte seule une bact�rie r�ceptrice est faible Cet ADN inject� doit survivre suffisamment longtemps pour former un transductant stable (�chapper aux endo et exonucl�ases, et s�installer par recombinaison ou transposition ou par r�plication autonome ) Qu�est ce qui fait qu�un phage peut �tre transductant? Il ne doit pas d�grader enti�rement l�ADN de l�h�te. Les motifs ADN d�empaquetage ou sites Pac (Packing) ne doivent pas �tre trop sp�cifiques.

37. La transduction

38. La transduction

39. La transduction : M.O.I.

40. La transduction de marqueur g�n�tique

41. La transduction de marqueur g�n�tique

42. Cartographie par cotransduction 

43. Cartographie de 3 marqueurs par analyse des fr�quences de cotransduction.

44. Cartographie 3 marqueurs par fr�quence d��v�nements de recombinaison

45. La r�gulation transcriptionnelle chez les bact�ries La transcription par l�ARN polym�rase d�une r�gion d�pend du motif de reconnaissance et de son accessibilit�

46. La r�gulation transcriptionnelle chez les bact�ries Evidence g�n�tique de r�gulation positive ou n�gative.

47. La r�gulation transcriptionnelle chez les bact�ries La compl�mentation r�v�le en g�n�ral une diff�rence suppl�mentaire pour les mutants constitutifs entre une r�gulation positive et n�gative

48. La r�gulation n�gative de l'op�ron lactose Si l'on fait pousser Escherichia coli dans un milieu contenant uniquement du lactose comme seule source de carbone et d'�nergie, on voit que la bact�rie produit une enzyme sp�cifique de l'utilisation de ce substrat : la b-galactosidase, alors que cette derni�re n'est pas d�tect�e sur un milieu contenant une autre source d'�nergie (de 0 � 1000 fois plus). Ceci est �galement vrai pour les autres substrats carbon�s tels que l'arabinose, etc.. except� le plus simple � "int�grer" dans les diff�rents cycles �nerg�tiques, le glucose. Il existe une r�ponse adaptative de la bact�rie. La b-galactosidase n'�tant induite qu'en pr�sence du lactose (inducteur).

49. Comment la bact�rie peut-elle savoir pr�cis�ment quel enzyme synth�tiser? F. Jacob et J. Monod ont obtenu deux type de mutants. des mutants lac- dans la r�gion ZY et aussi dans la r�gion lacI des mutants lac+ dans la r�gion I qui avait pour caract�ristique d'�tre constitutif (les g�nes ZYA sont tout le temps exprim�s) Ils ont montr� que cette r�gion I contr�le l'inductibilit� des g�nes ZYA. Ce contr�le ce fait par l'interm�diaire d'une prot�ine I diffusible ayant la capacit� de r�primer la transcription de ZYA.

50. Test de compl�mentation Notion de m�rodiploide

51. Mutations lac- r�cessives 

52. Mutations lac- r�cessives avec action en Cis Les mutations r�cessives qui ne peuvent pas �tre compl�ment�es affectent en g�n�ral un site ADN plut�t qu�un produit de g�ne diffusible.

53. Mutations lac- dominantes 

54. Mutations r�cessives constitutives 

55. Mutations dominantes constitutives avec action en trans