Split, 15.06.-17.06.2009.

1. OSNOVNI PRINCIPI BIOKEMIJSKE TOKSIKOLOGIJE TUMORAProf.dr.sc. Marija Definis-Gojanović, dr.med.e-mail: marija.definis-gojanovic@st.t-com.hr Split, 15.06.-17.06.2009.

2. BIOKEMIJSKI ASPEKTI TOKSIKOLOGIJE • Toksikologija multidisciplinarnost znanstveni početak ↑ broja kemikalija (> 100.000) važnost: predvidjeti toksičnost → biokemijska toksikologija (bilo koja strana tvar uzrokovat će promjene u biološkom sistemu → biološki odgovor)

3. BIOKEMIJSKI ASPEKTI TOKSIKOLOGIJE • Predmet: ispodležeći mehanizmi toksičnosti (molekularna razine; čimbenici koji određuju i utječu na toksičnost) Interakcija strane tvari s biološkim sistemom: a) efekt organizma na stranu tvar b) efekt strane tvari na organizam

4. BIOKEMIJSKI ASPEKTI TOKSIKOLOGIJE a) apsorpcija, distribucija metabolizam, ekskrecija b) tip djelovanja toksične supstancije,interakcija sa staničnim komponentama i, na molekularnoj razini, sa strukturalnim proteinima i drugim makro-molekulama, enzimima i receptorima, tip toksičnog odgovora DINAMIČNOST biološkog sistema!

5. BIOKEMIJSKI ASPEKTI TOKSIKOLOGIJE • na tipove interakcije utječe: anatomija i fiziologija organizma izloženost i ulazak tvari u organizam primjer: crijevne bakterije i cikazin (enzimska hidroliza → potencijalni karcinogen metilazoksimetanol) • distribucija strane tvari i njezin stupanj ulaza – određuju koncentraciju na određenom mjestu te broj i tip izloženih stanica

6. BIOKEMIJSKI ASPEKTI TOKSIKOLOGIJE • značaj ekskrecije – utjecaj na razinu u plazmi i tkivu • modifikacije ovisno o vrsti organizma, genetskim karakteristikama... • odgovor organizma sličan: put administriranja može uvjetovati efekat (sistemski ili lokalni) primjer: parakvat (lokalni iritant ili fatalna plućna fibroza)

7. BIOKEMIJSKI ASPEKTI TOKSIKOLOGIJE - obično: samo izloženo tkivo reagira, osim: indirektni efekt, npr. imunološki odgovor • distribucija tvari određuje: ciljno-specifični organ (! osjetljivost pojedinog tkiva) • toksični odgovor: tranzitorna biokemijska ili farmakološka promjena ili trajna patološka lezija

8. BIOKEMIJSKI ASPEKTI TOKSIKOLOGIJE • djelovanje: neposredno (npr. hipotenzija) odgođeno (npr. razvoj tumora) • “Nema štetne tvari, samo štetnog puta njene uporabe” = koncept toksičnosti kao relativnog fenomena

9. BIOKEMIJSKI ASPEKTI TOKSIKOLOGIJE - toksičnost ovisi o: dozi i vrsti tvari frekfenciji izloženosti organizmu nema apsolutne vrijednosti za toksičnost! - jedna tvar može uzrokovati više toksičnih odgovora primjer: vinil klorid – karcinogen u nižim dozama kroz dulje vrijeme, ali s narkotičkim i hepato-toksičnim djelovanjem nakon jednokratne visoke izloženosti

10. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR apsorpcija → distribucija ↔ metabolizam ekskrecija • Apsorpcija - lokalni ili sistemski učinak - najčešće: gastrointestinalni trakt i pluća rjeđe koža terapeutski agensi i drugim putevima

11. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR A) Transport kroz membranu • membrana - cca 70 Å (7 nm) debljine, nesimetrične strukture, s različitim tipovima fosfolipida i proteina • konstituenti membrane mogu biti i: - ugljikohidrati vezani na proteine (glikoproteini) lipide (glikolipidi) - esteri kolesterola (ugrađeni između fosfolipidnih molekula - utjecaj na konstituciju i mehaničku stabilnost membrane) - lipidi staničnih membrana pretežno: fosfatidil kolin, fosfatidil etanolamin, fosfatidil serin, sfingomijelin

12. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR • proporcija proteina i fosfolipida varira • različitost na unutarnjoj i vanjskoj strani – razlike u naboju • varijacije u sadržaju masnih kiselina (najčešće C16-C18) • različit stupanj nezasićenosti • dvostruke veze u membrani: značaj s toksikološkog aspekta (podložnost peroksidaciji) primjer: CCl4 – peroksidacija membranskih fosfolipida

13. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR • tipovi membrana: tip 1 – visoka proporcija lipida tip 2 i 3 – specifični nosioci tip 4 – s mnogo pora • funkcije membranskih proteina: strukturalne, receptorske, enzimatske • različita površina membrana: jetrene stanice, žučni kanalići • pore: hidrofilična i hidrofobična područja • selektivna permeabilnost!

14. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR B) fizikalno-kemijske karakteristike tvari: - veličina/oblik - topivost u mastima/hidrofobičnost - strukturalna sličnost s endogenom molekulom - naboj/polarnost

15. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR C) putovi prolaza kroz membranu: filtracija pasivna difuzija aktivni transport ubrzana difuzija fagocitoza/pinocitoza

16. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR • Filtracija kroz pore - difuzija kroz pore u membrani - niz koncentracijski gradijent - pore – vodeni kanali - prolaz - samo hidrofilne, u vodi topljive tvari s molekulskom masom <100 (npr. etanol, urea) - tvari u ioniziranom obliku, čak i mali ioni (npr. Na+) ne prolaze

17. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR • Pasivna difuzija kroz fosfolipidnu membranu - mehanizam transporta većine ksenobiotika - temelji se na difuziji kroz lipidni dvosloj - ne pokazuje specifičnost za supstrat - uvjeti za transport pasivnom difuzijom: topljivost ksenobiotika u lipidima neionizirano stanje ksenobiotika prolaz prema koncentracijskom gradijentu (veća ka nižoj koncenraciji)

18. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR • Aktivni transport - potreban specifični membranski nosač - potrebna energija - transport suprotno koncentracijskom gradijentu (od niže koncentracije višoj) - moguća saturacija procesa kod visokih koncentracija supstrata - moguća kompeticija sličnih supstrata u transportu kroz membranu

19. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR • Ubrzana difuzija - sličnosti s aktivnim transportom: - specifični proteinski nosač - proces transporta može biti zasićen ili kompetitivno inhibiran - specifičnosti: transport ksenobiotika isključivo niz koncentracijski gradijent nije potrebna energija tip transporta čest za endogene spojeve i esencijalne nutritiente (npr. glukoza)

20. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR • Fagocitoza / pinocitoza - potrebna energija - prolaz kroz staničnu membranu stvaranjem vezikula - unutar stanice poticaj enzimskim sustavima za razgradnju makromolekula • npr. azbest u plućnim intoksikacijama apsorpcija iz crijeva tvari molekulskih masa do 40 K

21. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR - Mjesta apsorpcije: - koža - gastrointestinalni trakt - pluća - intraperitonealni, intramuskularni, subkutani, intravenski

22. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR • Resorpcija kroz kožu - izloženost kože stranim spojevima: plinovi, otapala, tvari u otopinama - velika površina (čovjek - 18 000 cm2) - struktura kože - barijera za apsorpciju vanjski sloj - ne prokrvljeni epidermis: stanice s keratinom – mrtve stanice ograničuju apsorpciju dermis – daleko propusniji i prokrvljen

23. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR - resorpcija kroz kožu – pasivnom difuzijom - dobra resorpcija lipofilnih ksenobiotika primjeri: CCl4 – otapalo, nakon dermalne apsorpcije - sistemska toksičnost (oštećenja jetre) paration – insekticid, kontakt s kožom i apsorpcija - slučajevi smrtnosti u poljoprivrednih radnika

24. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR - oštećenja vanjskog rožnatog sloja epidermisa - povećana apsorpcija - toksična tvar može sama sebi olakšati apsorpciju oštećenjima na mjestu kontakta - ovisnost apsorpcije o mjestu penetracije toksikanta (taban – tjeme) - metaboličke aktivnosti epidermisa

25. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR • Resorpcija kroz pluća - glavno mjesto izloženosti i apsorpcije toksičnih plinova, hlapljivih tvari i anorganskih čestica iz zraka - velika površina 50-100 m2 - izvrsna opskrbljenost krvlju - resorpcija kroz tanke stijenke plućnih alveola (100 Å) neposredno u mrežu krvnih kapilara - brza resorpcija pasivnom difuzijom: lipofilnih tvari (otapala poput kloroforma) malih molekula (plinovi poput CO) otopine dispergirane u aerosole

26. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR - konstantni koncentracijski gradijent - otapanje u krvi osnovni faktor - perfuzijski limit / ventilacijski limit - čestice – bitna veličina (oko 6 µm) pneumokonioze - posljedica fagocitozne sposobnosti upijanja anorganskih čestica zadržavanje u respiratornom traktu - fibroze prekomjerno umnožavanje vezivnog tkiva - tumori profesionalna oboljenja - u građevinarstvu (azbest), rudarstvu (ugljena prašina), kemijskoj industriji, prehrambenoj industriji (otpadne cestice, prašina) itd. uranijum dioksid!

27. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR • Resorpcija iz probavnog trakta - glavni put apsorpcije ksenobiotika - razlike unutarnjeg ambijenta uzduž GI trakta: prvi kontakt ksenobiotika s oblogom usne šupljine - pH = 7 želudac: pH ~ 2, kratko zadržavanje ksenobiotika, duže vrijeme u slučaju ingestije s hranom tanko crijevo: pH ~ 6, dobra prokrvljenost, velika površina, naboranost unutarnje stijenke, obloženost crijevnim resicama - povoljni uvjeti za resorpciju

28. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR - apsorpcija ovisno o pH dijela trakta i fizikalno-kemijskim svojstvima tvari: npr. ne-ionizirane tvari topive u lipidima u želucu - apsorpcija pasivnom difuzijom, aktivnim transportom i fagocitozom - utjecaj drugih čimbenika: hrana, motilitet crijeva, crijevne bakterije - jetra: “prvi prolazeći učinak” - metabolička akrivnost samog GIT npr. izoprenalin u crijevima prelazi u inaktivni oblik

29. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR 2. Distribucija: - ulazak u krv ovisno o mjestu apsorpcije - ovisi o : koncentraciji i dispoziciji tvari - uključuje prolaz kroz stanične membrane - reakcija s plazma proteinima: ionsko vezivanje hidrofobična interakcija hidrogeno vezivanje Van der Waalsove sile značenje vezivanja (redukcija koncentracije slobodne komponente u plazmi, ograničenja distribucija tkivima, ograničena ekskrecija, saturacija, zamjena)

30. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR a) tkivna lokalizacija: distribucija ovisi o fizikalno-kemijskim karakteristikama tvari (ne-ionizirane, topive u mastima ili male molekule – brzi prolaz) ovisno i o: afinitetu za određene makromolekule (npr.CO za hemoglobin, Cd za metalotionein u jetri i bubregu) specijaliziranom aktivnom transportnom sistemu (npr. herbicid parakvat – poliaminski transportni sistem)

31. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR b) razina u plazmi - pod utjecajem je apsorpcije, distribucije, metabolizma i ekskrecije tvari, - reflektira koncentraciju tvari na ciljnom mjestu, - može dati neke indikacije o tkivnoj izloženosti, - može indicirati akumulaciju kod kronične izloženosti

32. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR c) volumen distribucije način na koji se strana tvar distribuira u vodi u tijelu utjecat će na koncentraciju tvari u plazmi: ukoliko se tvar distribuira samo u vodi plazme = koncentracija te tvari u plazmi bit će mnogo viša nego da se ona distribuira u svu ekstracelularnu vodu d) plazma polu-život označava vrijeme koje je potrebno da koncentracija neke tvari u plazmi padne na polovicu početne vrijednosti

33. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR 3. Biotransformacija pretvaranja u polarnije metabolite koji se brže izlučuju rezultat: transformacija roditeljske molekule česti porast težine i veličine molekule ubrzana ekskrecija posljedice: biološki polu-život skraćen trajanje ekspozicije reducirano akumulacija tvari u tijelu izbjegnuta biološka aktivnost moguće promijenjena katalizirano enzimima; važnost jetre

34. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR - vrste metaboličkih promjena faza 1 i faza 2 promjena originalne molekule uz dodatak funkcionalne grupe koja može biti konjugirana u fazi 2 (mogućnost i faze 3) a) faza 1: oksidacija redukcija hidroliza

35. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR Oksidacija katalizirana enzimima monooksigenaze, najvažniji citokrom P-450 (endoplazmatski retikulum) Redukcija većina reakcija su azo i nitro redukcije, a enzimi (reduktaze) nalaze se u mikrosomalnoj frakciji i u crijevnoj flori Hidroliza estera, amida, hidrazida i karbamata, a enzimi (karboksilesteraze i amidaze) obično su u citosolu

36. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR b) faza 2: konjugacija dodatak endogenih grupa (dostupnih, polarnih): formacija glukuronida sulfatna konjugacija glutationska konjugacija acetilacija (uključuje aktivaciju acetil CoA) metilacija u svrhu pojačanja polarnosti i smanjenja topivosti u mastima

37. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR 4. Ekskrecija: a) urinarna uglavnom male, u vodi topive molekule 3 mehanizma: filtracija difuzija aktivni transport !: urinarni pH utjecaj prehrane, dobi stupanj izlučivanja mokraće iz bubrega

38. ČIMBENICI KOJI UVJETUJU TOKSIČNI ODGOVOR b) bilijarna utjecaj: molekularne težine, polarnosti aktivni transport enterohepatična recirkulacija c) preko pluća pasivna difuzija iz krvi u alveole mogućnost stvaranja toksičnih metabolita (primjer: metilen klorid u ugljični monoksid) d) gastrointestinalni trakt pasivna difuzija u lumen crijeva (slabe baze ionizirane u želucu) e) ostalo: mlijeko, znoj, suze, pljuvačka pasivna difuzija ovisno o lipofilnosti tvari

39. TOKSIČNI ODGOVOR -vrste: direktno toksično djelovanje – oštećenje tkiva farmakološki,fiziološki i biokemijski efekti teratogeneza imunotoksičnost mutageneza karcinogeneza - rezultati: smrt patološke promjene biokemijske promjene fiziološke promjene promjene u normalnom statusu

40. KEMIJSKA KARCINOGENEZA - većina tumora rezultat je izloženosti okolišnim karcinogenima – prirodnima i proizvedenima od strane ljudi (1775.g., Sir P.Pott: ca skrotuma kod dimnjačara)

41. KEMIJSKA KARCINOGENEZA -utjecaj i: genetske predispozicije, spola, imunološkog odgovora -može uzrokovati: pojavu neobičnih tumora porast incidencije uobičajenih tumora raniju pojavnost povećati mnogostrukost

42. KEMIJSKA KARCINOGENEZA • Tipovi karcinogena: 1. Genotoksični – reagiraju s nukleinskim kiselinama direktnog djelovanja (primarni): alkilatni agensi prokarcinogeni: policiklički hidrokarboni, mikotoksini, anorganski spojevi anorganski spojevi (npr. nikal, krom, kadmij, arsen) - direktna karcinogeneza, aktivna bez metaboličke aktivacije: u kem. industriji, terapiji, kao dezinficijenski, insekticidi - indirektna karcinogeneza, aktivna nakon metaboličke aktivacije: izaziva većina genotoksičnih tvari specifičnih za vrste, za individue i za pojedine organe

43. KEMIJSKA KARCINOGENEZA • primjeri: 1. Policiklički ugljikohidrati - rašireni zagađivači okoliša, djeluju lokalno i sistemski; sve vrste senzitivne, iako postoje velike razlike među vrstama 2. Halogenirani ugljikohidrati - široko rasprostranjeni kao industrijske kemikalije i okolišni zagađivači; tu spadaju kloroform i ugljični tetraklorid koji induciraju jetrene tumore, halogeni olefini koji induciraju razvoj bubrežnih karcinoma u štakora 3. Mikotoksini, posebice aflatoksin (uginuća tuka u Engleskoj 1960.) - jedan je od najjačih potencijalnih jetrenih karcinogena u štakora i u drugih vrsta

44. KEMIJSKA KARCINOGENEZA • Tipovi karcinogena: 2. Epigentski - definiraju se kao karcinogene tvari za koje ne postoji DNA reakcija ali pokazuju druge biološke efekte koji mogu biti baza za njihovo karcinogeno djelovanje: citotoksični, promotori, solidnog stanja, hormoni, imunosupresanti, kokarcinogeni (npr.: nitriltrioctena kiselina, natrij saharin, sintetski estrogeni, azatioprin) - karcinogeneza induciranu stranim tijelima i krutim tvarima: učinci pločica plastičnih materijala (organski polimeri) - induciraju rast sarkoma na mjestu aplikacije, azbestna prašina - mezoteliom

45. KEMIJSKA KARCINOGENEZA • Tipovi karcinogena: 3. Neklasificirani peroksisomna proliferacija • povećavaju broj peroksizoma u jetri štakora i induciraju rast jetrenih tumora • značenje leži u katabolizmu dugo lančanih masnih kiselina, u metabolizmu kolesterola i moguće kemijskoj termogenezi • nema epidemioloških dokaza da peroksizomna proliferacija inducira pojavu jetrenih tumora u ljudi

46. KEMIJSKI KARCINOGEN DNA oštećenje? da ne genotoksični ne-genotoksični reakcija s DNA? stimulacija rasta? da ne da ne direktna indirektna povećani broj drugi genotok. genotok. stanica mehanizmi mitogeni? ne da inhibicija stanična staničnog proliferacija gubitka receptor? da ne modifikacija cito- staničnog toksičan signala

47. KEMIJSKA KARCINOGENEZA • Karcinogenetski proces: 1. Inicijacija 2. Promocija 3. Progresija • inicijacija: ireverzibilna promjena DNA – mogu se smatrati mutacije koje aktiviraju protoonkogene ili one koje inaktiviraju tumorsko supresorske gene • promocija: selektivna stimulacija rasta tj. dioba iniciranih stanica povećava se broj stanica koje mogu biti izložene daljnjim genetskim promjenama • progresija: daljnja genetska oštećenja i proliferacija stanica uz ekspresiju svojstava formiranje daljnjih mutacija sve do nastanka maligne stanice

48. KEMIJSKA KARCINOGENEZA • Karcinogenetski proces: - inicijator mora bit dat prije promotora - ponavljajuće doze inicijatora mogu uzrokovati tumor u odsutnosti promotora - inicijator proizvodi ireverzibilne promjene - inicijator je često kemijski reaktivan i interaktivan s DNA - razdoblje između inicijacije i izloženosti promotoru može varirari a da broj rezultirajućih tumora bude isti - izloženost promotoru obično je ponavljajuća a djelovanje je izgleda reverzibilno

49. KEMIJSKA KARCINOGENEZA • Karcinogenetski proces: • stupanj: vjeruje se da uključuje promjenu u genetskom materijalu stanice - teorija somatičke stanične mutacije – interakcija između genetskog materijala stanice i karcinogena (karcinogeneza je gotovo izjednačena s mutagenezom); ALI etionin je karcinogen ali nije mutagen, stiren oksid je mutagen ali nije karcinogen zaključak: sama mutacija nije dovoljna da uzrokuje razvoj tumora - epigenetski mehanizmi: originalna promjena u stanici možda neće obavezno biti mutacijska ili će možda biti indirektno

50. KEMIJSKA KARCINOGENEZA • Karcinogenetski proces: 2. stupanj: karakteriziran alteracijom u genskoj ekspresiji i rastom klona od inicirajuće stanice (depresija, represija, inhibicija intracelularne komunikacije) 3. stupanj: neoplastična stanica postaje maligni tumor (promjene u broju i uređenju kromosoma)