INFORME Nº2 ISLAMIENTO DE MICROOGANISMOS EN DIFERENTES AMBIENTES

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL “AÑODEL FORTALECIMIENTO DE LA SOBERANÍA NACIONAL” TEMA: AISLAMIENTO DE MICROOGANISMOS EN DIFERENTES AMBIENTES DOCENTE: Blgo. HERBERT HERNAN SOTO GONZALES CURSO: BIOTECNOLOGIA ESTUDIANTES: QUISPE DURAND SAHURY JELLITZA HANCCO LAROTA DIEGO WALDIR PANTA AURIS FABRICCIO PIERO SANCHEZ JAVIER ANGELA MATIHEL

2. TABLA DE CONTENIDO 1.INTRODUCCION .............................................................................................................................. 3 2.OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 3 2.1. ObjetivoGeneral ......................................................................................................................... 3 2.2. Objetivos Específicos .................................................................................................................. 3 3.MARCO TEORICO ........................................................................................................................... 3 3.1Antecedentes ................................................................................................................................. 3 3.2Bases Teóricas ............................................................................................................................... 4 4.METODOLOGIA............................................................................................................................... 5 4.1. MATERIALES ........................................................................................................................... 5 4.2. UBICACIÓN ............................................................................................................................... 8 4.3. PREPARACION DE CULTIVO ................................................................................................ 9 4.4. AISLAMIENTO ....................................................................................................................... 10 4.5. CULTIVO ................................................................................................................................. 10 4.6. CONTEO DE COLONIAS ....................................................................................................... 13 4.7. VISUALIZACION DE LO MICROORGANISMOS .............................................................. 14 5.RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................................... 14 6.CONCLUSIONES ............................................................................................................................ 21 7.ANEXOS ........................................................................................................................................... 22 8.BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................................. 23

3. 1.INTRODUCCION La liberación de contaminantes en el medio ambiente, tanto como el petróleo y sus derivados, son las causas principales de contaminación global. (Aguilar, 2013). Ante los impactos contaminantes, se contemplaban medidas convencionales, tales como la incineración, la detoxificación, técnicas de remediación. (Alcarraz, 2014). Las desventajas de usar las técnicas mencionadas, es que su ejecución suele ser costosa y de por si pueden perturbar el medio ambiente. Se plantean nuevas alternativas para dar solución a los problemas ambientales provocados por contaminantes fósiles, la biorremediación, una tecnología emergente que aprovecha la capacidad metabólica de los microorganismos. (Lorenzo, 2016). Para poder darle uso a los microorganismos, se realiza una forma de cultivo, para poder manejarlas de la manera que convenga. En este informe se presentará la base para la utilización de los microorganismos, comenzando desde la recolección de muestras, pasando al laboratorio para comenzar con el cultivo de los microorganismos, hasta el aislamiento de estas. 2.OBJETIVOS 2.1. ObjetivoGeneral Aislar y cultivar microorganismos. 2.2. Objetivos Específicos Preparación de cultivos adecuados para el desarrollo de microorganismos. Contabilización de colonias microbianas. Desarrollo de técnicas adecuadas para el aislamiento y cultivo. 3.MARCO TEORICO 3.1Antecedentes A nivel internacional, Álvarez María del Mar & Blando Lily, en el artículo científico “Aislamiento de Microorganismos en diferentes ambientes” explicaron los procedimientos iniciales en la obtención de microrganismos en base al aislamiento. Dicho aislamiento se realizó en ambientes distintos. Con

4. la finalidad de conocer los microorganismos a los que estamos expuestos diariamente. A nivel nacional, Alcarraz Mario & Vasquez George, en el artículo científico “Aislamiento de microorganismos halófilos con potencial biotecnológico y análisis de parámetros fisicoquímicos en suelos costero” Basándose en el aislamiento de los microrganismos un ambiente árido y altamente salino ubicadas en las zonas costeras de la capital del país. Esto fue realizado con el objetivo de identificar qué tipo de microorganismos están presentes, tras ser evaluados enzimáticamente, se dio a conocer sus capacitadas en el tratamiento de contaminantes, siendo importante en la bioprospección microbiana. 3.2Bases Teóricas i.Aislamiento Es la separación de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le acompañan. El método más frecuente es la siembra por estría sobre un medio de cultivo solido adecuado dispuesto en una placa Petri. ii.Microorganismos Organismo que solo puede verse bajo microscopio, entre ellas incluyen las bacterias, los protozoos, las algas y los hongos. iii.Disoluciones seriadas Consiste en inocular una serie de tubos de ensayos, en el que se coloca 900µL de agua destilada y luego 100µL la solución de la muestra, se inocula el primer tubo, se agita el mismo se retira 100µL que se inocula en el segundo tubo y así sucesivamente utilizando diferentes puntas de la micropipeta.

5. 4.METODOLOGIA 4.1. MATERIALES Pipeta Placas petri Agar Matraz Tubos de ensayo Balanza analítica

6. Agua destilada Vaso de precipitado Marcador indeleble Pabilo Incubadora Autoclave vertical

7. Papel film Cabina de flujo laminar Cinta de papel Bolsas ziploc Probeta Espátula Contador de colonias de bacterias Microscopio óptico

8. 4.2. UBICACIÓN Para el presente trabajo se tomaron muestras de dos puntos diferentes, el primero fue en los Humedales de Ite que se encuentra ubicado en el distrito de Ite, provincia de Jorge Basadre, en el departamento de Tacna y el segundo punto fue en el Rio Osmore que se encuentra ubicado en el distrito de Ilo, provincia de Ilo, en el departamento de Moquegua. Las coordenadas UTM del punto uno es: 19K 802193 S y 286144 E, las coordenadas del segundo punto son: 19K 8050068.49 S y 251603.63 E. Figura 1: Punto 1-Humedales de Ite Figura 2: Punto 2-Rio Osmore

9. 4.3. PREPARACION DE CULTIVO Primero se llevo a cabo la preparación de medios de cultivo (Agar nutritivo), para lo cual se realizó un pequeño calculo para saber la cantidad necesaria, según las indicaciones que venían en el frasco del Agar nutritivo 65gramos para 1000 ml. de agua, en nuestro caso serian solo 500 ml de agua por lo que se realizo una regla de tres simples y nos dio el resultado de 32.5 gramos. Luego pasamos a pesar el Agar nutritivo en la balanza analítica, luego se colocaba un vaso de precipitado en un agitador magnético y se le coloca 400 ml. de agua, mas los 32,5 gramos de Agar nutritivo a 400 rpm, una vez que no haya grumos se coloca la solución en una probeta hasta llegar a los 500 ml. se le agrega agua destilada, finalmente se coloca la solución en un frasco y se tapa. Figura 3: Pesando el Agar nutritivo Se realizó el autoclavado de todos los instrumentos de laboratorio que se utilizaran en la práctica. Para lo cual primero se debe envolver todos los materiales en papel craft y asegurar con cinta de papel y en algunos casos ajustar con el pabilo, luego se colocan los instrumentos en el canastillo de acero, se coloca agua desionizada en la caldera del autoclave hasta la línea demarcada, colocamos el canastillo dentro para poder ajustar la tapa del autoclave girando las llaves para que quede correctamente cerrado, encendemos el equipo, se debe esperar alrededor de 30 minutos para llegar a los 121C que es la condición para esterilización, cuando la temperatura llegue a 121C se debe esperar solo 15 minutos, al termino de este tiempo sonara una alarma se debe girar la perilla y dejar enfriar el autoclave para poder retirar el material.

10. Figura 4: Materiales en el equipo de autoclave 4.4. AISLAMIENTO Primero se pesó 2 g de sedimentos de los humedales de Ite y con una espátula se diluyó en el caldo nutriente esterilizado, este procedimiento de dilución se hizo en la campana de flujo ya que este es un lugar libre de contaminación, luego se agito para homogenizar y se dejó reposar todo un día en la incubadora. Figura 5 :1gr. de muestra de Ite y caldo nutriente 4.5. CULTIVO El medio de cultivo se distribuyó en 15 placas Petri de la siguiente manera.

11. Primero se retiró de la autoclave los medios de cultivo donde se sometieron a 105ºC por durante 15 minutos para poder derretir y fueron pasados a baño maría para bajar su temperatura. Figura 6 :Baño maría de los agares Para la distribución del medio de cultivo (caldo) en las placas petri debidamente rotuladas, se encendió el mechero perteneciente a la cabina de flujo con el fin de que toda la zona esté aséptica y únicamente nos salgan microorganismos que nosotros deseamos, luego se introdujo a la cabina de flujo las placas Petri y el medio de cultivo . Figura 7 :Cabina de flujo laminar y distribución del caldo nutriente a las placas petri

12. Posterior a esto recién se distribuyó cantidades similares y caldo nutriente a las placas siempre cerca del mechero, y estas fueron llevadas a la incubadora en bolsas ziploc para mantenerlas aisladas. Figura 8 :Placas petri Luego se utilizaron 8 tubos de vidrio en una gradilla y las placas con medio de cultivo preparadas en el paso anterior , para el cultivo se tomo 100 μL de la muestra de sedimento mas el caldo nutriente (inoculo) y 1000 μLde agua destilada el cual se coloco de la siguiente manera: Al primer tubo se coloco 100 μL de la muestra de sedimento mas el caldo nutriente (inoculo) y 1000 μL de agua destilada con micropipetas de 100 y 1000 μL y se agito . Al segundo tubo se le coloco 100 μL del tubo anterior y 1000 μL de agua destilada y así sucesivamente con el resto de tubos . Figura 9 :colocación de agua destilada en los tubos

13. Cabe resaltar que todo este procedimiento se realizó también en la cámara de flujo laminar y la técnica empleada fue la técnica de diluciones seriadas. Finalmente se tomó 100 μL de cada tubo y se lo coloco a cada placa Petri con micropipeta de 100 μL que tenga debidamente limpia su punta y se esparció con un esparcidor sobre la superficie de la placa. Figura 9:Esparcimiento en las placas petri Se dejo encubando en condiciones adecuadas durante aproximadamente 3 días. Cabe resaltar que las placas deben estar rotuladas de la siguiente manera: 4.6. CONTEO DE COLONIAS Luego de que las placas petri estuvieran en la incubadora se originaron colonias visibles las cuales fueron contabilizadas con un contador de colonias , contando siempre solo las colonias que no se encuentren juntas entre ellas . Figura 10:Placa petricon colonias de microorganismos

14. Luego estas fueron pasadas a placas petri con medios de cultivo ,muy cuidadosamente con un montadiente se pasa las colonias haciendo una pequeña raya por cada colonia para posteriormente visualizarlas, se debe utilizar un palito diferente para cada colonia así también todo este procedimiento se realiza en la cabina de flujo laminar . Figura 11 :Placa petricon colonias de microorganismos separadas 4.7. VISUALIZACION DE LO MICROORGANISMOS Para esta parte se colocó una muestra de cada colonia con un montadiente con un portaobjeto y se colocó cristal violeta (100 ul) para la visualización de microorganismos, finalmente se utilizó el microscopio Figura 12:Cristal violeta para observación de microorganismos y microorganimos observados 5.RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las placas Petri fueron inoculadas el día cinco de mayo y metidas a la estufa. Paso tres días para obtener los resultados siendo que en todas las inoculaciones de las muestras se encontró colonias

15. de bacterias en una mayor proporción las cuatro primeras inoculaciones -1, -2, -3, -4 (figura). En las demás inoculaciones se encontró colonias más separadas lo que nos permitió aislarlas (figura). Figura 13: muestra -1 descartada Figura 14: muestra -2 descartada Figura 15: muestra -3 descartada En la inoculación -5 se encuentra varias colonias aparentemente iguales sin embargo se pueden encontrar algunas que son transparentes. Se encontraron 56 colonias.

16. Figura 16: muestra -5 En la inoculación -6 empieza a disminuir el número de colonias a 30, se identifica cada vez colonias más grandes con forma parecida a un huevo frito y colonias agrupadas de un color oscuro. Figura 17: muestra -5 La inoculación -7 sucede un cambio bastante notable la disminución de colonias es mayor siendo 11 y se aprecia mejores colonias mucho más grandes. Figura 18: muestra -5

17. La inoculación -8 la disminución de colonias se reduce hasta 8 y teniendo la colonia más grande. Figura 19: muestra -5 Luego de terminar de contar las colonias se procedió al aislamiento de las bacterias en un medio cultivo (agar nutriente). Inicialmente se tenia las bacterias en delgadas líneas (figura) para luego meterlas a la estufa y esperar dos dias a que crezcan. Una vez sacado de la estufa se observó claramente el crecimiento de las bacterias uno en especial se expandió bastante y se formó pequeñas colonias arredro de las líneas. Figura 20: aislamiento de bacterias

18. Figura 21: resultado del aislamiento de bacterias Al termino de observar su crecimiento se uso un microscopio para observar con mejor detalle las bacterias con un objetivo de x10, x20, x30 y x40. En el aumento x10 no se distingue muy bien las bacterias apenas se notan como puntos, se observa hongos y burbujas de aire Figura 21: Observación de bacterias con aumento x10

19. En el aumento x20 se distingue un pequeño cambio, pero aún no se observa claramente las bacterias. Figura 22: Observación de bacterias con aumento x20 Con el aumento x30 ya se observabas las bacterias teniendo como características ser más alargadas y otras en forma de circulo

20. Figura 23: Observación de bacterias con aumento x30 Con el aumento x40 se tenía una calidad de imagen muy bueno, pudiendo identificar características de algunas bacterias. Figura 24: Observación de bacterias con aumento x40

21. Estos resultados concuerdan con Alvarez y Baldon que indican Si bien, en la Fig 1 y 2 se observan únicamente colonias bacterianas, se comprueba que estos microorganismos son los más encontrados en el suelo; además se observan colonias de diferentes colores y morfología Se confirma también que existen otros métodos del conteo de bacterias como lo hicieron Ramírez S enRecuento en cámara de Neubauer Saccharomyces cerevisiae. Los resultados del número de células por este método fueron de 100 cells/mm3 que al ser convertidas a la unidad utilizada para el patrón de McFarland fue de 1,0*105 cells/mL 6.CONCLUSIONES Los microrganismos son una alternativa para la biorremediación, evitando impactos negativos por el uso de técnicas de remediación que incluyan químicos. El cultivo de microrganismo nos ayuda a reproducirlas para poder conservarlas o utilizarlas en biorremediación o estudios que nos permitan conocer sus ventajas.

22. El éxito del aislamiento de microorganismos, va a depender de la separación sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor número de estrías posible ya que las primeras estarán cargadas mientras que en las últimas las colonias estarán separadas. Si bien se encontraron colonias en las muestras inoculadas aun no podemos identificarlas correctamente y preservar bacterias puntuales. Es de suma importancia porque al tener identificado podremos usarlas correctamente para diversos usos o como en nuestro caso producción de bioelectricidad. 7.ANEXOS Figura 1: Envolviendo los materiales con papel craft Figura 2: Distribución del medio de cultivo Figura 3: Muestras inoculadas Figura 4: Recolectando muestras

23. 8.BIBLIOGRAFIA Revelo, D. M., Hurtado, N. H., & Ruiz, J. O. (2013). Celdas de combustible microbianas (CCMs): Un reto para la remoción de materia orgánica y la generación de energía eléctrica. Informacion https://doi.org/10.4067/S0718-07642013000600004 Buritaca H., H. M., Mejía, M., & Álvarez, M. D. M. (2017). Aislamiento de Microorganismos en diferentes ambientes (Suelo, Agua y Aire). Mente Joven, 6. https://doi.org/10.18041/2323-0312/mente_joven.0.2017.3666 Tenorio, C., Reyna, R., & Narciso, T. (2019). Identificación Fitoquímica Y Aislamiento De Microorganismos Endófitos De Agave Americana. FLEPS 2019 - IEEE International Conference on Flexible and Printable Sensors and Systems, Proceedings, 6(1). Tecnologica, 24(6).