医学免疫学实验

1. 医学免疫学实验

2. 一、凝集试验 吞噬试验 • 二、沉淀试验 溶血反应 • 三、免疫标记技术； 免疫细胞的分离； 细胞免疫功能测定

3. 实验一 • （一）凝集试验 • 1、直接凝集反应（ABO血型鉴定） • 2、间接凝集反应（类风湿因子测定） • 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验 • （二）吞噬试验（示教）（310室） • 1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬） • 2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）

4. （一）凝集试验 • 1、直接凝集反应（ABO血型鉴定） • 2、间接凝集反应（类风湿因子测定） • 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验 （什么是凝集试验或直接、间接、协同凝集试验？）

5. 免疫学检测技术 • 利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。 • 一、 抗原抗体的检测→凝集试验 • 二、 免疫细胞功能的检测→吞噬试验 • 三、其他，如细胞因子的检测

6. 如何检测抗原或抗体？（基本原则） 抗原 ＋ 抗体 抗原抗体反应现象 （抗原抗体结合反应的高度特异性） ？ ＋ 抗体 抗原 ＋ ? 有现象（有相应抗原） 无现象（无相应 抗原） 有反应现象（有相应抗体) 无反应现象（无相应抗体）

7. （形成可见的大抗原抗体复合物合适条件：） Ab Ab Ag＜＜Ab： Ag ，游离Ab Ab Ag Ab Ab Ab Ag＋Ab→ Ag－Ab→ Ag、Ab比例合适： (visible) Ag－Ab Ag (unvisible) Ab （凝集或沉淀） Ag Ag Ag＞＞Ab： ，游离Ag Ab

8. Ab excess Ag excess Equivalence – Lattice formation (Visible)

9. 【凝集反应】： （1）概念： 颗粒性Ag＋Ab →（凝集块） 可溶性Ag＋Ab →（沉淀物） Ag Ab Ab Ab Ag－Ab Ag （细菌、细胞） Ab （凝集反应） Ag Ab Ab Ag－Ab Ag （蛋白质、多糖） （沉淀反应） Ab

10. （2）类型 一定条件 颗粒性Ag＋Ab 凝集块（直接凝集反应） 可溶性Ag－载体 ＋ Ab → 凝集块（间接凝集反应） （细胞、细菌等） （正向间接凝集反应） 可溶性Ag ＋ 载体－Ab → 凝集块（反向间接凝集反应） Ag ＋ 金葡菌－Ab 凝集块（协同凝集反应） （致敏载体?）

11. （3）凝集试验检测原理 一定条件 ①颗粒性Ag＋Ab 凝集块（直接凝集反应） ？ ＋已知Ab ② Ag ＋ 金葡菌－Ab 凝集块（协同凝集反应） ？＋金葡菌－已知Ab 凝集（有对应Ag） 一定条件 无凝集（无对应Ag） 凝集（有对应Ag） 一定条件 无凝集（无对应Ag）

12. （一）1、ABO血型鉴定 直接凝集反应： 颗粒性抗原 + 抗体 凝集块 RBC 抗A或抗B 凝集块

13. 血型 RBC抗原 抗A 抗B A A抗原 + - B B抗原 - + AB 有A、B + + O 无A、B - -

14. 实验步骤： • 1、制备红细胞悬液。 • 2、加抗A或抗B。 • 3、加红细胞悬液。 • 4、结果观察。 • （2人/组）

15. Bilateralis of the ring finger tip

16. （一）2、血清类风湿因子测定 • 正向间接凝集反应、血球凝集试验： 可溶性Ag－载体 ＋ Ab 凝集 人IgG-红细胞 类风湿因子 （致敏红细胞） （待测） （半定量） （效价）

17. 效价（滴度）：以出现明显抗原抗体反应现象（＋＋及以上）的最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的效价，可反应待检物含量。效价（滴度）：以出现明显抗原抗体反应现象（＋＋及以上）的最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的效价，可反应待检物含量。 9 10 1.稀释液 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve 50ul 2.待检血清（1：10） （Ab?） 50ul 弃去50 50 50 50 50 50 50 50 Ab稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560

18. 1.稀释液 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve 50ul 2.待检血清（1：10） （Ab?） 50 弃去50 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 3. 加Ag 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul 50 Ab最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:320 4. 现象 ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － +++ ++ ++ + - - - - 1:160 ＋＋ ＋ ＋ － － － － － 1:40 + - - - - - - - ＜ 1:40 5. 效价＞1：40，判断待检标本为抗体（类风湿因子）阳性；否则阴性 （效价）

19. 可能结果1： 第1孔 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ++++ +++ +++ ++ ++ + - - - ++++

20. Result 1: -ve control +ve control 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ++++ +++ +++ ++ ++ + — — — ++++ Agglutination deposition ++++ +++ +++ ++ ++ + — — — ++++

21. standards to judge agglutination: ++++ all the red blood cells agglutinate +++ most red blood cells agglutinate ++ half red blood cells agglutinate  no agglutination all, agg.most, agg.half, agg.few, agg.no agglutination ++++ +++ ++ + -

22. all, agg.most, agg.half, agg.few, agg.no agglutination ++++ +++ ++ + - （ +++ ） （ ++ ）

23. (result 1) Agglutination deposition ++++ +++ +++ ++ ++ + - - - ++++ 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 titer is 1:320; So, titer ＞ 1:40, Test sample (sample serum) is positive. Rheumatoid factor is positive. Rheumatoid factor is at relatively high concentration.

24. (result 2) Agglutination deposition ++++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ - ++++ 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 maybe, titer is 1:5120, or ＞ 1:5120, So, titer ＞ 1:40, Test sample (sample sera) is positive. Rheumatoid factor is positive, in high level. +

25. (result 3) Agglutination deposition ++++ +++ +++ ++ ++ - - - - ++++ 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 titer is ?, (titer ＞ 1:40, or titer ＜ 1:40?) Test sample (sample serum, rheumatoid factor) is positive or negative?

26. Titer： The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (++) is called the titer. • The results are also reported as the reciprocal of the maximal dilution that gives visible agglutination.

27. So, • Titer, 1:320 ( or 320), • Titer, 1:160 ( or 160), • Titer, 1:20 ( or 20),

28. 28 • If Titer ＞ 1:40 (or ＞ 40 ), positive (Ab positive) • If Titer ＜ 1:40 (or ＜ 40 ), negative (Ab negative) • Titer, 1:320 ( or 320), ＞1:40(＞40), rheumatoid factor positive • Titer, 1:160 ( or 160), ＞1:40(＞40), rheumatoid factor positive • Titer, 1:20 ( or 20), ＜1:40 (＜40), rheumatoid factor negative

29. （一）3、协同凝集试验 Ag ＋ 金葡菌－Ab →凝集块(协同凝集反应) 金葡菌 SPA 已知抗体 （ 致敏金葡菌 ）

30. 请按照实验指导讲义方法进行操作； • 注意观察第1格内的凝集现象，并分析第2、3格为何不出现凝集。

31. 先做类风湿因子测定 • 微量移液器的使用

32. How to Use a Micropipettor • Set the desired volume by turning the centrally located rings. (Never exceed the upper or lower limits of pipettors. 20~200ul) • Place a tip on the discharge end of the pipettor. • Depress the plunger until you feel the initial resistance and insert tip into the solution, just barely below the surface of the liquid and not as deep as possible.(for accurate/precise volume)

33. Carefully and slowly release plunger. (Allow the pipet tip to fill to final volume before removing it from solution to avoid the presence of bubbles in the plastic tip.) • Discharge the solution into the appropriate container by depressing plunger. • Remember to change tips between solutions to avoid mixing or contaminating the solutions used.

34. （二）非特异性免疫实验───吞噬试验（示教）（二）非特异性免疫实验───吞噬试验（示教） • 1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬） • 了解小吞噬试验检测意义、原理，观察中性粒细胞及其吞噬的葡萄球菌；（310室） • 2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬） • 了解大吞噬试验检测意义、原理，观察巨噬细胞及其吞噬的鸡红细胞。 （310室）

35. Phagocytic cells monocyte neutrophil

36. Phagocytic cells

37. 脑膜炎奈瑟菌 中性粒细胞内的脑膜炎奈瑟菌_革兰染色

38. Macrophage Attacking E.coli Innate immune response

40. 实验报告（今天交）：

41. 附：反复感染的儿童应该做哪些免疫试验 • 一、检查血清免疫球蛋白(即抗体)有无异常或缺陷 ； • 二、检查外周血象和淋巴细胞计数； • 三、做皮肤迟发性超敏反应试验；

42. 附：反复感染的儿童应该做哪些免疫试验 • 当怀疑免疫缺陷时，建议进行实验室筛查试验，包括全部血细胞计数及分类计数（淋巴细胞计数）和血小板计数;测定IgG，IgM和IgA浓度;抗体功能测定等 ； • 若所有这些筛查试验均正常，则免疫缺陷(特别是抗体缺陷)可排除。但若证实有慢性感染，病史毫无疑问或筛查试验阳性，则必须进一步作高级试验检查。

43. B细胞(抗体)缺陷的试验　 • 只要总免疫球蛋白很低(<200mg/dl)，就可确立抗体缺陷的诊断，再结合其他一些试验用于确定具体的疾病和检定有无其他免疫缺陷 • 如用荧光抗B细胞特异抗体(如CD19，CD20)经流式细胞仪来计算B细胞 • 进一步进行血清IgG亚类，IgD和IgE浓度测定等

44. T细胞缺陷的试验 • 1.胸部X线检查是筛查婴儿T细胞缺陷的有用方法 （如看不到胸腺影像，提示有T细胞缺陷 ）； • 2.做皮肤迟发性超敏反应试验（迟发型皮肤超敏反应试验对2岁以上儿童是有价值的筛查T细胞缺陷的试验）； • 3.诊断细胞免疫最有价值的先进试验是T细胞和T细胞亚群(辅助/诱导细胞和抑制/细胞毒细胞)的计数 • 4.测量病人淋巴细胞增殖和增大(转化)能力的另一种有效的先进试验 • 5.其他：测细胞因子等等

45. 吞噬细胞缺陷的试验 • 当病人有确切的免疫缺陷病史而B细胞和T细胞免疫正常时，需检查有无吞噬细胞障碍 • 如四唑氮蓝(NBT)还原试验 • 吞噬作用还可通过计数分离的粒细胞或单核细胞吞噬胶乳粒子或细菌的情况作检测 • 大、小吞噬作用

46. 补体缺陷的试验 • 补体异常的筛查是测定血清总补体活性(CH50)以及血清C3，C4浓度。发现其中任何一种浓度低下时，必须接着做经典途径和替代途径的补体滴定，和各个补体成分的测定 • 还可用抗血清测定补体调控蛋白；遗传性血管性水肿多伴有C1抑制物缺陷，C3分解代谢过盛的C3缺陷伴有Ⅰ因子(C3抑制物)缺陷。测定血清调理活性，趋化活性或杀菌活性可作为判断补体功能的间接试验。

47. 效价（滴度）：以出现明显抗原抗体反应现象（＋＋及以上）的最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的效价，可反应待检物含量。效价（滴度）：以出现明显抗原抗体反应现象（＋＋及以上）的最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的效价，可反应待检物含量。 1.稀释液 50μl 50 50 50 50 50 50 50 弃去50 2.待检血清（1：10） （Ab?） 50 Ab稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560

48. 1.稀释液 50μl 50 50 50 50 50 50 50 弃去50 2.待检血清（1：10） （Ab?） 50 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 3. 加Ag 50μl 50 50 50 50 50 50 50 Ab最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 效价 4. 现象 ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － 1:320 +++ ++ ++ + - - - - 1:160 ＋＋ ＋ ＋ － － － － － 1:40 + - - - - - - - ＜ 1:40 5. 效价＞1：40，判断待检标本为抗体（类风湿因子）阳性；否则阴性

49. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1.diluent 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve 50ul 2.sample sera (Ab?) (1：10) 50ul 50ul 50 50 50 50 50 50 (Discard 50ul) resultant dilution 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 3. Ag 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul 50ul final dilution 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 —++++ 4. results 1:320 ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － Patient 1 Patient 2 ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ---- 1:160 Patient 3 ＋＋ ＋ ＋ － － －－－ 1:40 +---- --- ＜ 1:40 Patient 4 ( titer ) 5. titer＞1:40，Ab positive. ( titer＞40，Ab positive )