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不同标准中单增李斯 特氏菌的检测方法 蔡向荣 青岛高科园海博生物技术有限公司

不同标准中单增李斯 特氏菌的检测方法 蔡向荣 青岛高科园海博生物技术有限公司. 单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病 原菌。. 它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和 单核细胞增多 。死亡率高达 30% 。最常见的后果为导致胎儿或新生儿的脑膜炎或流产。. 它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在 2-30℃ 的环境中仍可生长繁殖，而且对热的耐受性较强，常规的巴氏消毒法不能杀灭，加工中心温度７０摄氏度以上２分钟才可被杀灭。是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。.

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不同标准中单增李斯 特氏菌的检测方法 蔡向荣 青岛高科园海博生物技术有限公司

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  1. 不同标准中单增李斯特氏菌的检测方法蔡向荣青岛高科园海博生物技术有限公司不同标准中单增李斯特氏菌的检测方法蔡向荣青岛高科园海博生物技术有限公司 单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病 原菌。 它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。死亡率高达30%。最常见的后果为导致胎儿或新生儿的脑膜炎或流产。 它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在2-30℃的环境中仍可生长繁殖，而且对热的耐受性较强，常规的巴氏消毒法不能杀灭，加工中心温度７０摄氏度以上２分钟才可被杀灭。是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

  2. 以下比较不同标准中单增李氏菌的检测方法： 一、FDA的检测方法 通用检测方法 样品制备、前增菌、选择性增菌培养 选择性分离培养 确证试验

  3. 1、样品制备 • 样品混合液的制备: • 无菌操作从10个样品中各取50ml或50g,每五种样品混合成一份250ml或250g,共分两份(注意取样要均匀).两份混合液都加入250ml的BLEB,振荡混匀.每份样品匀液各取50ml(固体取25ml)分别放入200ml BLEB中,同时再各取50ml(固体取25ml)置于5℃冰箱中保存,以备计数. • 非混合液的制备: • 若不需要样品混合物,则只需取25g样品放入225ml的BLEB中,混匀,增菌培养.同时贮存25g样品以备计数.非冷冻样品,应置于5℃下保存;冷冻样品置于保鲜冰箱中保存,不能冷冻.

  4. 2、前增菌培养和增菌培养 在BLEB 增菌液中30℃培养4h后，加入选择性试剂,继续30℃培养48h.若没有放线菌酮,也可用25mg/L的匹马菌素代替,且比放线菌酮更安全.巴氏消毒乳、乳制品、酸乳酪、冷冻水产品等,含有较少的酵母菌和较少霉菌,因此不需加入抗菌剂.但生乳、干的海产品或新鲜产品则需加入抗菌剂. 在增菌培养中，所使用的培养基为缓冲李斯特氏菌增菌液(BLEB)。是否能检测出单增李斯特氏菌，培养基的质量至关重要。好的增菌液接种10个单增李斯特氏菌，通过增菌培养24-48小时，可增菌到1-10亿个菌/ml；不好的增菌液仅能增菌到1万个菌/ml，若有杂菌干扰便不能分离出目标菌。本公司对比了不同厂家的李氏菌增菌液，足可说明此问题。通过下表说明，我公司的EB增菌液可增菌到10-8，国内厂家仅增菌到10-4、10-5，国外增菌到10-8。AOAC实验表明,增菌液菌浓度10000cfu/ml,平板培养大约100cfu/ml.因此,若增菌液中菌浓度太低,试验结果可能会给出错误的阴性结果.

  5. 不同厂家李氏菌增菌液的对比试验

  6. 3、选择性分离培养 • 在24和48h时,挑取BLEB上的菌落划线接种于任何一种含七叶苷的选择分离培养基上：OXA、PALCAM、MOX或加入七叶苷和三价铁的LPM。以上含七叶苷的培养基根据具体要求而选用。OXA、PALCAM、MOX平板接菌后放置于35℃培养24-48小时，含七叶苷和三价铁的LPM平板接菌后放置于30℃培养24-48小时。特别推荐以下单增李斯特氏菌与绵羊李斯特氏菌所用的选择性显色培养基，例如BCM、ALOA等培养基培养48小时( 也可培养24小时)，这样可以减少绵羊李斯特氏菌掩盖单增李斯特氏菌。 • 在含七叶苷的培养基上，李氏菌呈黒色，菌落周围具有黒色的环。一些其它的细菌在两天以后或更长的时间，能够形成淡棕黒色的菌落。

  7. 从OXA、PALCAM、改良LPM培养基或MOX培养基上， • 挑取5个典型菌落划线接种到TSAye培养基上，分离纯化单菌 • 落。同样也可划线接种到BCM培养基，单增李斯特氏菌呈蓝 • 色，而绵羊李斯特氏菌在食品中不常见。单增李斯特氏菌和 • 绵羊李斯特氏菌在ALOA培养基下都呈蓝色且在菌落周围有酯 • 酶环。在传统的检测方法中，利用TSAye培养基进行菌落纯 • 化是必须的，因为选择性培养基上分离出的菌落仍有可能包 • 涵有其它细菌。至少挑取5个菌落，由于在同一样品中可能含 • 有几种李斯特氏菌。BCM和ALOA培养基可以减少挑取的菌 • 落数。运用商业的Confirmatory培养基，或传统的木糖/鼠李 • 糖发酵肉汤或琼脂，可以区别单增李斯特氏菌和绵羊李斯特 • 氏菌。TSAye平板需在30℃培养24-48小时，若不需观察运 • 动，也可在35℃培养。 • 从上面FDA的方法中，可知所采用的选择性分离平板为 • OXA或PALCAM或MOX或改良LPM培养基，从中选取一种 • 即可，同时FDA特别重点推荐采用李斯特氏菌显色培养基。

  8. 李氏菌在OXA上 李氏菌在PALCAM上

  9. 单增李斯特氏菌在ALOA显色培养基上

  10. 单增李斯特氏菌在ALOA显色培养基上

  11. 4、确证试验 • 检测TSAye平板上的典型菌落形态，用斜射光观察是非常有帮助，但不是必须的。 • 从30℃或低于30℃培养的平板上挑取生长良好的典型菌落，涂于洁净载玻片上，用0.85%生理盐水制成悬浮液，压上盖玻片于相差显微镜的油镜下观察。李斯特氏菌为短杆状，有轻微的旋转和翻滚运动。而大的杆状，或快速运动的杆状细菌则不是李斯特氏菌。应用阳性的李斯特氏菌做对照。 • 过氧化氢酶试验：李斯特氏菌阳性反应。 • 革兰氏染色试验：将培养16-24小时的培养物进行染色。李斯特氏菌呈短杆状阳性菌。但若培养时间过长，染色会发生变化。细胞呈现Coccoidal菌现象。着色轻的部位呈现栅栏状，被当作类白喉菌排除掉。 • 挑取典型菌落接种到TSBye培养基(进行糖发酵试验)和其它检测培养基上，35℃培养24小时，这些培养物可置于4℃冰箱中保存数天，以重复利用。商业化的试剂盒也可于分离鉴定(见E-11)。 • 溶血试验：将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从TSAye上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，于35℃培养24-48小时，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂。

  12. 于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增李斯特氏菌和西尔李斯特氏于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增李斯特氏菌和西尔李斯特氏 菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血 环，绵羊李斯特氏菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别 李斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来确证李斯 特氏各种菌。(注意：当血平板的厚度比通常的5mm更薄时，非常 容易观察到溶血环，另外这可以通过覆盖一层血琼脂1-2mm来实 现)。 • 硝酸盐还原试验：这个试验是非必需的。只有默氏李斯特氏菌能降 解硝酸盐，从而区别开格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌。用 TSBye肉汤培养物接种到硝酸盐肉汤中，35℃培养5天，加入0.2ml 试剂A，再加入0.2ml试剂B，混匀，如出现紫红色，则表明降解了 硝酸盐，存在亚硝酸盐。如无颜色变化，则加入少量锌粉，放置1 小时，如出现红色，表明仍有硝酸盐存在，未被细菌降解。也可按 以下过程进行检测:加入0.2ml试剂A，再加入0.2ml试剂C，混匀，如出现 桔红色，则表明降解了硝酸盐，存在亚硝酸盐。如无颜色变化，则加入少 量锌粉，放置1小时，如出现桔红色，表明仍有硝酸盐存在，未被细菌降 解。 • 动力试验：由TSBye肉汤培养物接种到SIM培养基或MTM培养基， 室温培养7天，逐日观察，李斯特氏菌有动力，呈伞状生长。从 MTM培养基上形状尤为突出，可以明显观察到伞形。另外，通过相 差显微镜，可以观察30℃ TSBye培养基上的培养物的翻滚运动。

  13. 糖发酵试验： • 将TSBye上培养物接种于含以下0.5%糖的紫色肉汤中(可加入小倒管)：葡萄糖、七叶苷、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖。35℃培养7天。阳性反应是产酸不产气。不同菌种的生化反应见表1。所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖都是阳性反应。除格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌外的李斯特氏菌对甘露醇呈阴性反应。若OXA、PALCAM、MOX或LPM(加七叶苷和三价铁)的纯化物着色是确定的，则七叶苷发酵实验可省略 • CAMP试验：当溶血试验结果不确定时，可用CAMP实验来区别李斯特氏菌的各个种。在羊血琼脂平板上划两条平行线，两条线上分别接种β型溶血金黄色葡萄球菌与马红球菌培养物。在该两线之间，垂直划线，接种待测培养物，与两线相近但不相交，于35℃培养24-48小时后，观察溶血情况。单增李斯特氏菌与西尔李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌接种点附近的溶血增强，其它李斯特氏菌不溶血。单增李斯特氏菌在24小时溶血现象比在48小时更明显。为使马红球菌能长出一条很好的划线，需要将斜面培养物培养48小时，而不是24小时。同时，羊血琼脂平板需新鲜配制。 • 李斯特氏菌血清学试验 • 小鼠毒力实验 • 实验数据解释 • 计数（要求）：若样品经实验确定含有单增李斯特氏菌，那就要用保存的那部分进行计数

  14. 二、USDA-FSIS检测方法 1、样品制备(略) 2、增菌培养 第一步增菌培养：用UVM肉汤，30±2℃培养22±2h 第二步增菌培养：用Fraser肉汤，从UVM增菌肉汤中取0.1±0.02ml培养液加入10±0.5ml Fraser肉汤中， 35±2℃ 培养24-48小时。 3、选择性分离培养 取0.1ml 30±2℃培养22±2h UVM肉汤培养物，划线接种到MOX平板上， 35±2℃培养24-48小时，检查有无黑色菌落，并菌落外围有黑色环。 Fraser肉汤培养26±2小时，出现明显黑色，取0.1±0.02ml培养物接种到MOX平板上35±2℃至少培养24小时，若Fraser肉汤培养26±2小时，没有出现明显黑色，继续培养至48±2小时，出现明显黑色，取0.1±0.02ml培养物接种到MOX平板上35±2℃至少培养24小时。若培养48小时，仍没有出现明显黑色，并在XOA上没有可疑菌落，则此样品为单增李斯特氏菌阴性。

  15. 从XOA平板上挑取至少20个可疑菌落，接种到HL琼脂平板上， 35±2℃培养18-26小时，在暗光线下检查是否有小的β溶血环。如果有，挑取单菌落进行确证试验。如果没有，此样品为单增李斯特氏菌阴性。 4、确证试验(略)

  16. 李氏菌在Half-FRASER和 FRASER培养基上

  17. 李氏菌在血琼脂平板上

  18. 三、ISO检测方法 1、样品制备(略) 2、增菌培养 第一步增菌培养：用Half-Fraser肉汤，30℃培养24h 第二步增菌培养：用Fraser肉汤，从Half-Fraser肉汤中取0.1ml培养液加入10ml Fraser肉汤中,35℃培养24-48小时。 3、选择性分离培养 取0.1ml 30±2℃培养24h Half-Fraser肉汤培养物，划线接种到PALCAM平板上， 35℃培养24-48小时，检查有无黑色菌落，并菌落外围有黑色环。 Fraser肉汤培养24小时，出现明显黑色，取0.1±0.02ml培养物接种到MOX平板上35℃至少培养24小时，若Fraser肉汤培养24小时，没有出现明显黑色，继续培养至48小时，出现明显黑色，取0.1ml培养物接种到PALCAM平板上35℃至少培养24小时。若培养48小时，仍没有出现明显黑色，并在PALCAM上没有可疑菌落，则此样品为单增李斯特氏菌阴性。

  19. 4、确证试验(略) 5、结论： ISO方法中，增菌培养采用二步增菌培养法，并可通过增菌液的颜色变化来判断有无李斯特氏菌，所采用的增菌培养基为Half-Fraser 肉汤和Fraser肉汤。所用的分离平板为PALCAM培养基。本方法几乎可用于所有食品中李斯特氏菌的检测。

  20. 四、SN检测方法 1、样品制备(略) 2、前增菌和增菌培养 • 前增菌：巴氏消毒乳，乳制品、冷冻水产品、冻肉及其他加工食品均应进行前增菌。 无菌操作称取25g样品，加入装有225ml的改良缓冲蛋白胨水的均质杯内，高速均质1-2min，制成1：10样品均液，转入500ml广口瓶内；液体食品可用吸管吸取同上，30℃培养24h、48h，称取1ml，转种于100ml增菌培养液（EB增菌液）内，于30℃培养24h、48h，分别进行分离。 • 直接增菌：生乳、鲜肉及未经加工处理过的样品，不必经过前增菌。检验时，以无菌操作称取25g（ml）样品，按前法所述，用225mlEB增菌培养液代替改良缓冲蛋白胨水制成1：10样品均液，于30℃培养24h和48h，分别进行分离。

  21. 3、选择性分离培养 • 取增菌液一环，划线接种于选择性培养基，（MMA或OXA）平板上，35℃培养24-48h。 • 斜射光检验：将解剖镜、斜射灯、平面镜，使光源以45度角照射到平面镜上，再反射为解剖光源。将MMA平板放在解剖镜载物台上，通过目镜垂直向下观察，李斯特氏菌在此平板上，呈蓝色或蓝灰色，扁平圆润，稍有突起，边缘整齐，菌落较小，均为0.5mm左右，使用解剖镜观察，并挑取5个可疑菌落，划线接种于胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（YSA-YE）平板，于35℃培养18-24h，纯培养后进行鉴定。 • 黑色菌落观察，李斯特氏菌在OXA平板上，生长24h后菌落呈黑色，直径1mm在其周围形成一个黑色环。培养48h，菌落仍呈黑色，直径2-3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。挑取5个可疑菌落，接种于胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（YSA-YE）平板，纯培养后鉴定。

  22. 4、确证试验(略) 5、结论： SN方法中，前增菌采用改良缓冲蛋白胨水，增菌培养采用EB增菌液。 所用的分离平板为MMA培养基或OXA琼脂。

  23. 检样 EB增菌液25ml LB1增菌液225ml 五、GB检测方法 LB2增菌液225ml 选择性培养基（MMA SIM动力培养基 TSI琼脂 TSA-YE培养基 MR-VP试验 硝酸盐还原试验 革兰氏染色 显微镜下观察运动 过氧化氢酶试验 甘露醇试验 木糖试验 鼠李糖试验 七叶苷试验 溶血试验 协同溶血试验 小鼠致病性试验

  24. 1、样品制备(略) 2、增菌培养 a、EB增菌液放30±1℃培养48h～7d, b、LB1增菌液30±1℃，培养24h,取出0.1mL，加入10mL LB2增菌液中30±1℃，培养24h 3、选择性分离培养 • 将EB增菌液和LB2次增菌液划线接种于MMA琼脂平板上，培养30±1℃48h，挑选可疑菌落,用白炽灯 角斜光照射平板,李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色,小的圆形的菌落。 • 选 5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TSI)琼脂和EIM动力培养基,培养于25±1℃, 观察是否有动力,且成伞状或 月芽状生长。一般观察2～7d,阳性者可做下一步鉴定。

  25. 4、确证试验(略) 5、结论： GB方法中，增菌培养采用三种增菌液，分别为：EB增菌液和二步增菌培养法(LB1、LB2增菌液)。所用的分离平板为MMA培养基。主要缺点是菌落特点不明显，菌落特征不易观察。

  26. 六、不同标准中培养基对比

  27. 七、本公司推荐的培养基 • 1、前增菌和增菌培养基： • A、MBP、EB增菌液 • B、Half-Fraser肉汤和Fraser肉汤 • 2、选择性分离培养基 • OXA琼脂 • PALCAM琼脂 • 李斯特氏菌显色培养基

  28. 谢谢大家 TEL：0532-8721769 • WWW.HOPEBIOL.COM • E-mail:info@hopebiol.com • 青岛高科园海博生物技术有限公司

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