Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática: Inibição enzimática

1. Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática: Inibição enzimática Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – USP adriane@debiq.eel.usp.br

2. Cinética enzimática • Sumário: • Inibição reversível • Modelos de inibição • Modificação química • Inibição irreversível

3. INIBIÇÃO ENZIMÁTICA INIBIDORES REVERSÍVEISIRREVERSÍVEIS Competitivos Não Competitivos Incompetitivos Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.

4. INIBIÇÃO COMPETITIVA: substrato e inibidor competem para o mesmo sítio Km kcat K4[E] [I] = K5[EI [K5] = [E] [I] [K4] [EI] 1) V = K3 [ES] 2) [ET] = [E] +[ES] +[EI] V = K3 [ES] [ET] [E] +[ES] +[EI] [E][S] V = Vmax Km [E] + [E][S] + [E][I] Km Ki V = Vmax [S]______ Km (1 +[I]) + [S] Ki

5. INIBIÇÃO COMPETITIVA V = Vmax [S]______ Km (1 +[I]) + [S] Ki Km (1 +[I]) + [S] 1= _____Ki_______ V Vmax [S] Km (1 +[I]) 1 = _____Ki__ 1 + 1 V Vmax [S] Vm 1- sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

6. INIBIÇÃO INCOMPETITIVA: substrato e inibidor ligam-se em sítios diferentes

7. INIBIÇÃO INCOMPETITIVA:

8. INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA 1- sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

9. INIBIÇÃO MISTA α

10. Diagrama Lineweaver-Burk para inibição mista

11. EQUAÇÃO GERAL DE INIBIÇÃO Km K3 α αKm βK3 α = ∞ e β = 0 - Inibição competitiva pura 1 < α <∞ e β = 1 - Inibição competitiva parcial α = 1 e β = 0 - Inibição não competitiva pura α = 1 e 0< β <1 - Inibição não competitiva parcial 1 < α <∞ e β = 0 - Inibição tipo misto 1 < α <∞ e 0< β <1 – Inibição do tipo misto com β# 0

12. Para inibições com diagnóstico hiperbólico 1_____ interc. 1_____ interc. 1_____ inclin. 1_____ inclin. βVm 1-β βVm Ks(α- β) 1__ [i] -β αKi

13. INIBIÇÃO PELO PRODUTO

14. INIBIÇÃO PELO SUBSTRATO Se K4 = 0 Se 0 < K4 < K2

15. Exemplo 1: Síntese de Dopamina

16. Exemplo 2: Fosfofrutoquinase Frutose 6P Frutose 1,6 BiP ATP ADP

17. MODIFICAÇÃO QUÍMICA Moléculas específicas podem interagir com a enzima inibindo-a Inibidores irreversíveis K2 E + M F em que: E – enzima M – modificador F – enzima modificada inativa K2 - constante de segunda ordem V = K2 [M][E] V = KOBS [E] Log Enzima Remanescente (%) KOBS = K2 [M] K2 = KOBS M Kobs t

18. Log Kobs n Log M Segundo caso: n é o numero de moléculas para inativar a enzima k2 F e [M] >>> [E] E + nM Kobs = k2 Mn Log Kobs = log K2 + nlog M

19. meia vida – 23 anos Inibidores irreversíveis: Compostos orgânicos clorados ou fosforados reagem com o resíduo S1 de serino-enzimas, formando um complexo irreversível. Uma das enzimas altamente sensível a esses compostos é a acetilcolinesterase, responsável pela metabolização do neurotransmissor acetilcolina em neurônios centrais e periféricos. Este é o mecanismos de ação dos inseticidas organofosforados, como o malathion e o parathion. Inseticidas organofosforados dose letal: 3-13 mg/Kg, oral “gás dos nervos” (dose letal 0,01 mg/kg, oral),

20. SO2F H3C No laboratório, serino-enzimas podem ser identificadas por serem eficientemente inibidas por compostos organofosforados menos tóxicos como o diisopropilfluorofosfato (DFP) ou o fluoreto de fenilmetilenosulfonila (PMSF). PMSF phenylmethane sulphonyl fluoride

21. Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na disponibilidade de S e da própria E ? A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas vezes atuam em conjunto na mesma enzima. Entre estes mecanismos, destacam-se: • Inibidores: • irreversíveis: não protéicos e protéicos • reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo • Alosteria: • ativadores e inibidores • cooperatividade • Modulação covalente • Fosforilação e defosforilação • Ativação de zimogênios Agora vamos falar de:

22. enzima fosfato substrato Ao contrário da alosteria, em que os efetores ligam-se à enzima apenas por ligações fracas, na modulação covalente a enzima é modificada covalentemente por duas outras enzimas: uma quinase fosforila a enzima às custas de ATP, e uma fosfatase remove o grupo fosfato da enzima fosforilada. A modulação covalente é energéticamente cara, pois necessita duas outras proteínas e ATP para regular a atividade de uma enzima. Ao contrário, na alosteria a enzima é controlada pelas concentrações relativas de seus efetores e a afinidade da enzima por estes. Fosforilação - Defosforilação fosfatase ativa inativa quinase

23. Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na disponibilidade de S e da própria E ? A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas vezes atuam em conjunto na mesma enzima. Entre estes mecanismos, destacam-se: • Inibidores: • irreversíveis: não protéicos e protéicos • reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo • Alosteria: • ativadores e inibidores • cooperatividade • Modulação covalente • Fosforilação e defosforilação • Ativação de zimogênios Agora vamos falar de:

24. Ativação de zimogênios é um caso específico de modulação covalente exclusivo de alguns tipos de enzimas proteolíticas. • zimogênios: as proteases são sintetizadas numa forma inativa por estar em uma conformação desfavorável, com bloqueio ou desalinhamento dos resíduos do sítio catalítico. • conformação desfavorável resulta de porções adicionais da cadeia poli-peptídica, que devem ser retirados para que a proteína assuma a forma ativa. • podem acontecer duas situações, combinadas ou não: • - zimogênio tem uma extensão N-terminal (pro-segmento) que precisa • ser retirada. Pro-segmentos podem ter de 2 a 150 resíduos a.a. • - zimogênio tem cadeia polipeptídica única, que precisa ser clivada • (proteólise limitada) para formar duas ou mais subunidades. • conversão do zimogênio à protease ativa pode resultar da ação proteolítica de outra protease, ou de alteração do pH ou temperatura do meio, ou ainda, da adsorção do zimogênio à uma superfície negativa. Esses eventos determinam mudança conformacional e/ou auto-hidrólise pela própria protease. • ativação é irreversível, e porisso, energeticamente cara para o organismo.