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主要内容

主要内容. 一. 二. 三. 四. 五. 研究背景与意义. 技术路线. 研究内容. 结果与讨论. 小结与展望. 1 柑橘黄龙病发生与危害 发生危害：柑橘黄龙病是世界性柑橘生产上的一种毁灭性病害，起源于中国，现已在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的 40 多个国家相继发生 发病症状：斑驳黄化和均匀黄化、红鼻子果 发病规律：少数新梢叶片黄化，次年黄化扩大至全株，使树体衰退. 一、研究背景与意义. 普通 PCR. 一、研究背景与意义. 2 柑橘黄龙病病原及检测技术. 病原菌 ：（不可培养）

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Presentation Transcript

  1. 主要内容 一 二 三 四 五 研究背景与意义 技术路线 研究内容 结果与讨论 小结与展望

  2. 1 柑橘黄龙病发生与危害 发生危害：柑橘黄龙病是世界性柑橘生产上的一种毁灭性病害，起源于中国，现已在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的40多个国家相继发生 发病症状：斑驳黄化和均匀黄化、红鼻子果 发病规律：少数新梢叶片黄化，次年黄化扩大至全株，使树体衰退 一、研究背景与意义

  3. 普通PCR 一、研究背景与意义 2 柑橘黄龙病病原及检测技术 病原菌：（不可培养） Candidatus Liberibacter 优 先 选 择 定量PCR 巢式PCR

  4. 一、研究背景与意义 3 柑橘黄龙病的防治方法 防治木虱 栽无病苗 防治方法 植物检疫 挖去病树 栽培管理

  5. 多样性：129种(隶属于54个属) 功 能：农业、基因工程、环境保护 一、研究背景与意义 4 内生细菌多样性研究 生物防治

  6. 1 2 柑橘内生细菌资源的进一步开发与利用 为柑橘黄龙病的生物防治提供理论依据 一、研究背景与意义 研究意义

  7. 二、技术路线 柑橘黄龙病田间 调查和样品采集 柑橘黄龙病病原 检测及16SrDNA分析 柑橘内生菌 脂肪酸提取 实蝇引诱剂 柑橘内生 细菌分离纯化 柑橘内生菌群落 结构多样性研究 内生细菌 16S rDNA鉴定 PLFAs气相色谱分析 PLFAs成分分析(Sherlock MIS) 内生细菌多样性

  8. 三、研究内容 1 2 3 4 柑橘黄龙病田间调查和样品采集 柑橘黄龙病病原检测及16S rDNA序列分析 柑橘黄龙病株内生细菌多样性 柑橘黄龙病植株内生菌空间分布PLFAs多态性

  9. 1 柑橘黄龙病田间调查和样品采集 1.1 田间调查 • 时间：2010年7月23日 • 地点：顺昌县赵氏园艺技术 • 研究所果树基地 • 方法：采取田间实地观察记载的方 • 法，调查果树基地黄龙病发 • 病症状和发病数

  10. 1 柑橘黄龙病田间调查和样品采集 1.1 田间调查 果园中共有5600棵红心柚 (Citrus grandis Osbeck cv. Chandler)， 其中有16棵植株表现出黄龙病症状，发病率为0.29%。 顶部黄化红心柚 果园概况图

  11. 柑橘均匀黄化叶片 柑橘斑驳黄化叶片 1 柑橘黄龙病田间调查和样品采集 1.1 田间调查

  12. 1 柑橘黄龙病田间调查和样品采集 1.2 样品采集 将植株按东、西、南、北四4方向，每个方向再划分上、中、下部位，共12个方位

  13. 进化树构建 序列比对 2 柑橘黄龙病病原菌检测及16S rDNA序列分析

  14. 检出率为58.33% 2 柑橘黄龙病病原菌检测及16S rDNA序列分析 2.1 柑橘黄龙病病原菌检测 • 随机选取16株黄龙病植株中1株取其不同方位叶片，进行柑橘黄龙病原检测 • 病原检测方法：Nested-PCR 不同部位叶片黄龙病病症表型及其黄龙病病原检测结果

  15. 黄龙病病原菌为亚洲型 （Candidatus Liberibacter asiaticus） 1500 bp 3000 bp 1000 bp 2000 bp 600 bp 500 bp 1000 bp 500 bp 2 柑橘黄龙病病原菌检测及16S rDNA序列分析 2.2 柑橘黄龙病病原菌16S rDNA的序列测定分析 XbaI酶切 引物OI1和OI2c扩增 片段 柑橘黄龙病病原菌16S rDNA部分核苷酸序列 柑橘黄龙病病原16Sr DNA序列系统发育树

  16. 3 柑橘黄龙病植株内生细菌多样性 3.1 柑橘内生细菌的分离与鉴定 叶 枝 101 102 103 根 细菌16S rDNA鉴定

  17. 第I大类为革兰氏阳性菌，分为芽胞杆菌属和短小杆菌属两个亚类第I大类为革兰氏阳性菌，分为芽胞杆菌属和短小杆菌属两个亚类 第II大类为革兰氏阴性菌，分为α-变形菌纲细菌和γ-变形菌纲两个亚类 第 I 大 类 第 II 大 类 3 柑橘黄龙病植株内生细菌多样性 3.1 柑橘内生细菌的分离与鉴定 Bacillus sp. Bacillus cereus Bacillus flexus Bacillus subtilis Bacillus pumilus Bacillus altitudinis Brevibacillus brevis Curtobacterium citreum Curtobacterium flaccumfaciens Curtobacterium pusillum Methylobacterium variabile Brevundimonas vesicularis Sphingomonas Pseudosanguinis Pseudomonas fluorescens Acinetobacter calcoaceticus Escherichia coli Escherichia hermannii Enterobacter asburiae Enterobacter amnigenus 红心柚内生细菌系统进化树 结果表明，26株内生细菌分别属于10个属

  18. 3 柑橘黄龙病植株内生细菌多样性 3.2 柑橘黄龙病原菌与内生细菌的相关分析 B.pumilus和Bacillus sp. 与黄龙病病原菌呈显著负相关 B.cereus和A.calcoaceticus与黄龙病病原菌正相关不显著 其他内生细菌与黄龙病病原菌之间存在负相关，但相关性不显著 柑橘黄龙病原菌与内生细菌的相互关系(PCC) HLB Pathogen FJAT-10078(Bacillussubtilis) FJAT-10060(Bacillus cereus) FJAT-10074 (Bacillus pumilus) FJAT-10067 (Bacillus sp.) FJAT-10076 (Acinetobacter calcoaceticus) FJAT-10064 (Escherichiahermannii) FJAT-10071 (Escherichia coli) I II λ =6.18 III

  19. 3 柑橘黄龙病植株内生细菌多样性 3.3 柑橘叶片内生细菌的多样性 内生细菌的平均含量在上、中、下不同高度叶片差异不明显，在东、西、南、北不同方向叶片存在显著差异 红心柚内生细菌在不同方向叶片中的含量统计 红心柚不同内生细菌在叶片中的含量统计 红心柚内生细菌在不同水平叶片中的含量统计

  20. 3 柑橘黄龙病植株内生细菌多样性 3.4 柑橘枝条内生细菌的多样性 枝条内生细菌在上、中、下3个不同高度枝条中平均含量差异不明显，但在东、西、南、北4个不同方向枝条平均含量差异显著。 红心柚不同内生细菌在枝条中的含量统计 红心柚内生细菌在不同方向枝条中的含量统计 红心柚内生细菌在不同水平枝条中的含量统计

  21. 3 柑橘黄龙病植株内生细菌多样性 3.5 柑橘不同器官内生细菌群落结构多样性 不同器官内生细菌的多样性指数 SHANNON指数在叶片最高，根部最低。SIMPSON指数在枝条最高，根部最低。均匀度在根部最高，枝条最低 第Ⅰ类特点是在不同部位叶片均有分布，为完全分布类型，且分布量较大 第Ⅱ类特点是在各器官中均为不完全分布类型，且分布量不均匀 第Ⅲ类特点是根部分布特性且分布量较大 Bacillussubtilis Bacillus cereus Bacillus pumilus Bacillus sp. Acinetobacter calcoaceticus Escherichiahermannii Curtobacterium flaccumfaciens Curtobacterium citreum Escherichia coli Curtobacterium pusillum Pseudomonas fluorescens Methylobacterium variabile Brevibacillus brevis Bacillus flexus Bacillus altitudinis Sphingomonas pseudosanguinis Brevundimonas vesicularis Enterobacter amnigenu Enterobacter asburiae I Ⅱ λ=27.23 III

  22. 4 柑橘黄龙病植株内生菌PLFAs多态性分析 将果园黄龙病症状的红心柚16株，按东、西、南、北四4方向，每个方向再划分上、中、下部位，共12个部位的样本 柑橘不同样品PLFAs的分析方法

  23. 4 柑橘黄龙病植株内生菌PLFAs多态性分析 4.1 内生菌磷脂脂肪酸生物标记的分布特性 共42种磷脂脂肪生物标记 第Ⅰ大类为非完全分布脂肪酸 第Ⅱ大类包含9种完全分布脂肪酸 Ⅰ Ⅱ λ=48.79 红心柚黄龙病株不同空间叶片内生菌PLFAs聚类分析

  24. 4 柑橘黄龙病植株内生菌PLFAs多态性分析 4.2 红心柚黄龙病株不同方向和不同高度叶片PLFAs比较 东面叶片PLFAs总量最高 下部叶片PLFAs总量最高 红心柚黄龙病株不同高度叶片PLFAs含量 红心柚黄龙病株不同方向叶片PLFAs含量

  25. 4 柑橘黄龙病植株内生菌PLFAs多态性分析 4.3 红心柚黄龙病株不同部位内生菌PLFAs多样性指数 不同方向叶片内生菌种群多样性指数差异显著 不同高度的叶片内生菌种群多样性指数差异不显著 红心柚黄龙病株内生微生物种群多样性指数

  26. 4 柑橘黄龙病植株内生菌PLFAs多态性分析 4.4 红心柚黄龙病株不同部位内生菌PLFAs主成分分析 82.99% 红心柚黄龙病株不同空间叶片内生种群PLFAs图谱主成分分析

  27. 1 顺昌赵氏园艺技术研究所果树基地红心柚黄龙病感染率仅为0.29%，但是较集中，需及时处理；顺昌柑橘黄龙病病原菌为亚洲型，正常叶片也会携带病原 3 PLFAs分析结果表明，共获得42种磷脂脂肪生物标记；不同朝向内生微生物PLFAs含量差异显著，东面的最大；而不同高度内生微生物PLFAs含量差异不显著 2 红心柚内生芽胞杆菌为优势菌株黄龙病病原菌与两株红心柚内生细菌呈显著性的负相关；叶片SHANNON指数，枝条SIMPSON指数，根部内生细菌均匀度都为最高 五、结论与展望 结论

  28. 1 2 3 研究亚洲型黄龙病病原菌在柑橘中的分布 寻找更多和黄龙病病原呈负相关的细菌 试图寻找可以培养黄龙病病原菌的方法 五、结论与展望 展望

  29. 发表论文 [1] 孙大光，郑雪芳，刘波，夏育陆，段永平. 柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析[J]. 福建农业学报，2011，26(6)：1302-1308. [2] 刘波，郑雪芳，孙大光，阮传清，范国成，段永平. 柑橘黄龙病株不同部位内生细菌群落结构的多样性[J]. 生态学报，2011，31(24)：7325-7342 [3] 郑雪芳，刘波，孙大光，段永平，夏育陆，阮传清，肖荣凤. 柑橘黄龙病植株体内微生物PLFA多态性研究[J]. 中国生态农业学报，2012 (已录用)

  30. 致 谢 首先要感谢我的导师刘波研究员。刘老师严谨的学术作风，孜孜不倦的工作作风，脚踏实地、追求创新的科研精神让我们感同身受。特别是他鼓励我们独立自主开展科研实验，使我学会了自主创新，对科研实验的认识也有了质的飞跃。感谢郑雪芳老师在实验室管理、日常生活和学习等方面都倾注的大量的心血。 最后感谢我的家人，谢谢你们。 祝愿各位老师身体健康，心想事成!祝愿各位同学和朋友们学业有成，事业丰收!

  31. 谢谢

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