培养基和试剂质量控制方法 GB 4789.28-201X

1. 培养基和试剂质量控制方法GB 4789.28-201X 北京陆桥技术有限责任公司 技术服务电话：0532-82689263 技术部邮箱：sd@beijinglandbridge.com 销售服务电话：0532-82689263

2. 主要内容 培养基简介 1 培养基质量保证 2 培养基的质量要求 3 培养基性能测试方法 4 测试结果的记录 5 培养基常见问题 6

3. 1、培养基简介 培养基 液体、半固体或固体形式的、含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖（含或不含某类微生物的抑菌剂）、鉴定或保持其活力的物质。 1.1 定义

4. 1、培养基简介 1.2 分类 1.2.1 按组成成分分类 1.2.2 按状态分类 1.2.3 按用途分类 1.2.4 按制备方法分类

5. 1、培养基简介 1.2.1 按组成成分分类 • 纯化学培养基：仅含有已知分子结构和纯度的化学成分的培养基。 • 未定义和部分定义的化学培养基：全部或部分由天然物质，加工过的物质或其他不纯的化学物质构成的培养基。

6. 1、培养基简介 1.2.2 按状态分类 液体培养基：一种或多种成分组成的水溶液。如：脑心浸出液肉汤、营养肉汤； 半固体培养基和固体培养基：含一定量固化物（琼脂、明胶等）的液体培养基。 半固体培养基：含0.2%-0.8%琼脂粉，多用于细菌的动力观察、菌种传代保存及贮运细菌标本材料等。 固体培养基：含1.5%-2%琼脂，多用于细菌的分离、鉴定、菌种保存

7. 1.2.3 按用途分类

8. 1.2.4 按制备方法分类 即用型培养基：以即用形式或融化后即用形式置于容器内供应的液体、半固体和固体培养基 脱水合成培养基：使用前需加水和进行处理的干燥培养基 自制培养基：依据完整配方的具体成份配制的培养基 1、培养基简介

9. 2、培养基质量保证 标明培养基各种成分、添加成分名称及产品编号； 批号 培养基最终pH值 储藏信息和有效期 质控证书和测试菌株 性能测定结果及验收标准 必要的安全和/或危害数据 每批培养基，应验收： 产品合格证明 包装的完整性 产品的有效期 生产企业文件的提供 记录接受日期 质量保证—培养基生产企业提供文件 质量保证—培养基使用者

10. 2、培养基质量保证 2.1 脱水合成培养基——制备流程

11. 2.2脱水合成培养基——制备注意事项 概述：严格按照厂商提供的使用说明配置。 水：实验用水的电导率在25℃时不应超过25μS/cm，相当于电阻率≥0.4MΩcm。 微生物污染≤103/mL，最好在102/mL以下；定期检查实验用水是否受到微生物污染。 2、培养基质量保证

12. 2、培养基质量保证 2.2脱水合成培养基——制备注意事项 pH值测定和调整： 使用pH计测定； 灭菌后冷却至25℃时测定pH值； pH值应在标准pH±0.2范围内； 使用1mol/L的氢氧化钠或盐酸溶液调整培养基的pH值。 （如需灭菌后调整pH值，则使用灭菌溶液）

13. 2、培养基质量保证 灭菌方式： 湿热灭菌； 煮沸灭菌； 过滤除菌： 注意避免过度加热： 1.大容积（＞1000mL)时容易过度加热； 2. 放置物品太多或灭菌后未及时冷却。 2.2脱水合成培养基——制备注意事项 SC正常加热 SC过度加热

14. 2.3脱水合成培养基——使用注意事项 灭菌或复溶后培养基放入47℃-50℃的恒温水浴锅中，冷却保温，直至使用； 培养基只可复融一次，融化后的培养基应尽快使用，放置时间不应超过4小时，未使用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。 个别培养基使用前需要脱氧：松开容器盖子，沸水浴或蒸气浴中加热15min，盖紧盖子，迅速冷却，如 FT培养基。 2、培养基质量保证

15. 2、培养基质量保证 2.4菌株定义 标准菌株：至少定义到属或种水平的菌株，按菌株特性进行分类和描述，官方菌种保藏机构获得，最好来源于食品或水； 标准储备菌株：将实验室获得或供应商提供的标准菌株转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株； 储备菌株：从标准储备菌株转接第一代的培养物； 工作菌株：由标准储备菌株或储备菌株，或由经证明或未证明的标准物质转接一代获得的菌株 指在均一固定的浓度中含有具活性的定量化菌种， 经证明的标准物是指其浓度已经证明。

16. 2、培养基质量保证 标准/质控菌株主要来源 美国菌种保藏中心 American Type Culture Collection Center,ATCC （英国）国家菌种保藏中心 (UK) National Center for Typical Culture Collection,NCTC 中国工业微生物菌种保藏管理中心 China Center for Industrial Culture Collection ,CICC 中国医学微生物菌种保藏中心 China Center for Medical Culture Collection ,CMCC 注：陆桥均可代购以上菌株

17. 2、培养基质量保证 CMCC菌株（国产） ATCC菌株（进口） 注：ATCC菌株提供证书，可以自行到其网站下载。

18. 2、培养基质量保证 标准菌株 (冻干菌种） 转种活化 标准储备菌株 （-80℃冰箱保存的培养物） 转种活化 储备菌株 （4℃冰箱保存的培养物） 转种活化 工作菌株 （用于培养基微生物质控的新鲜培养物） 详细请参考附录C

19. 获得标准菌株 通常悬浮于营养肉汤中 适宜时间进行复苏 验证和文件归档 依据生产商指引进行复苏 在5%的血琼脂、TSA或其它 适合的固体培养基上进行分离 验证菌落形态和革兰氏染色 或用生化试验进行鉴定 验证菌株的纯度和特性 NO 例如：TSB添加10%-15% 甘油作为冷冻保护培养基 符合 YES 用适合的培养基制备菌悬液 在不高于-70℃低温冷冻保存 可延长保存的时间。 禁止采用较高的温度保存。 分装进行冻存或冻干 获得储存菌株

20. 标准储备菌株 符合 迅速解冻 YES 此流程更合适 在适合的固体培养基 上培养 在适合的固体培养基 上培养=工作菌株 验证菌株的纯度和形态 验证菌株的纯度和形态 NO NO 符合 YES 接种到合适的培养基或 冻存菌悬液=工作菌株 贮存物或贮存培养物 制备用于测试的 工作菌株 在适合的培养基 上分离=工作菌株 YES NO 验证纯度 制备用于测试的 工作菌株 符合

21. 3、培养基质量要求 基本(感官和理化)要求： 微生物要求： —分装的量和/或厚度 —外观、色泽和均一性 —琼脂凝胶的硬度 —水分含量 —20 ℃-25 ℃的pH值 —缓冲能力 —微生物污染测试（只适用于即用型培养基） —生长特性 1、生长率 2、选择性 3、特异性 4、抗菌试验特性 注：详细参照GB 4789.28附录F培养基质量控制标准 性能评价和结果解释： 1、所有测试菌株的性能测试达到标准，则该批培养基的性能测试结果符合规定； 2、基本要求和微生物要求均符合规定，则该批培养基可被接受。

22. 3、培养基质量要求 水分测定仪 质构仪 电极式pH计

23. 3、培养基质量要求 生长特性概述 a）定量方法； b）半定量方法； c）定性方法。 注：使用以上方法时，应使用参考培养基进行对照，有助于结果的解释。 培养基生产商 自制培养基 新培养基或新供应商产品 其他特殊要求 培养基性能测试第一法 通常可满足实验室的培养基性能检测要求 选择近期批次中质量良好的， 或具有长期稳定性的批次培养基或即用型培养基

24. 4、培养基性能测试方法 非选择性固体分离和计数培养基 选择性固体分离和计数培养基 4.1定量方法 悬浮培养基和运输培养基 非选择性固体分离和计数培养基 选择性固体分离和计数培养基 4.2半定量方法 非选择性液体增菌培养基 选择性液体增菌培养基 选择性液体计数培养基

25. 4、培养基性能测试方法 非选择性固体分离和计数培养基 选择性固体分离和计数培养基 非选择性液体增菌培养基 4.3定性方法 选择性液体增菌培养基 选择性液体计数培养基 悬浮培养基和运输培养基 Mueller Hinton血琼脂 鉴定培养基和实验试剂

26. 将适当稀释度的目标菌0.1mL分别涂布于待测培养基平板和参考培养基平板（可用螺旋平板法或倾注法），经培养后，计算PR。将适当稀释度的目标菌0.1mL分别涂布于待测培养基平板和参考培养基平板（可用螺旋平板法或倾注法），经培养后，计算PR。 PR = NS/NO PR：生长率； NS：待测培养基平板上得到的菌落总数； NO ：参考培养基平板上获得的菌落总数，应≥100CFU。 结果解释： 非选择性培养基和选择性计数培养基上目标菌的生长率应不小于0.7； 选择性分离培养基上目标菌的生长一般不小于0.5，最低应为0.1。 4、培养基性能测试方法 4.1 定量方法 ——非选择性、选择性固体计数和分离培养基 接种水平为 20CFU~200CFU

27. 例：木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD） 测试菌株：鼠伤寒沙门氏菌，福氏志贺氏菌； 10倍稀释，选取适宜稀释度0.1mL涂布XLD平板和TSA参比平板，36℃±1℃培养 18h~24h； 计数： 4、培养基性能测试方法 (132+139)/2 (130+135)/2 PR = NS/NO= PR = NS/NO= =0.78 =0.72 (172+175)/2 (182+187)/2 4.1 定量方法 ——非选择性、选择性固体计数和分离培养基 鼠伤寒沙门氏菌： 福氏志贺氏菌：

28. 待测培养基分装试管，10mL/支（或5mL/支）； 目标菌浓度选择：100CFU~1000CFU； 接种后，混匀： 立即吸取1mL，用相应培养基倾注平板； 剩余已接菌的待测培养基置20℃~25℃放置45min，再吸取1mL用相应培养基倾注平板； 分别按标准方法中规定的培养条件培养后，计数； 结果观察与解释： 待测培养基中的菌落数变化应在±50%内。 4、培养基性能测试方法 4.1 定量方法 ——悬浮培养基和运输培养基

29. 制备106~108CFU/mL 的工作菌悬液； 用1μL接种环划线平板，A区用按0.5cm的间隔划四条平行线，按同样方法在B、C区划线，最后在D区划一条连续曲线； 培养后，评价菌落的形状、大小和生长密度，计算生长指数G； 每条有菌生长的划线记为1分，如果仅一半的线有菌生长，记为0.5分，没有生长或生长量少于划线一半的，记为0分； 结果解释： 目标菌在培养基上应呈典型的生长，目标菌生长指数G大于6，培养基可接受；非选择培养基的G值通常较高。 4、培养基性能测试方法 4.2 半定量方法 ——非选择性、选择性固体计数和分离培养基

30. 非目标菌半定量测试方法 用1μL接种环划线平板，划六条平行直线； 每条有菌生长的划线记为1分，如果仅一半的线有菌生长，记为0.5分，没有生长或生长量少于划线一半的，记为0分； 结果解释 非目标菌的生长应部分或完全被抑制。 4、培养基性能测试方法 4.2 半定量方法 ——选择性固体计数和分离培养基 注：操作时用接种环而不用接种针，接种环完全浸入培养基中，取一满环接种物，接触容器边缘3次，去除多余液体。划线时，接种环与琼脂表面的角度应为20°-30°，接种环压在琼脂表面的压力和划线速度前后一致，整个划线应快速连续，移取液体培养物时应将接种环伸入培养液下部分以防止环上产生气泡或泡沫。

31. 培养基分装，10mL/支； 新鲜菌液10倍稀释后，选取10CFU~100CFU稀释度工作菌悬液； 取1mL工作菌悬液接入待测培养基； 同时取1mL倾注平板，做接种量计数用； 按标准方法中的培养时间和温度进行培养（如增菌时间为8h以下，取10μL增菌液倾注平板，再按适合的时间和温度培养，结果按附录F判定）； 结果解释： 0 表示无混浊； 1 表示很轻微的混浊； 2 表示严重的混浊 目标菌的浊度值应为2. 4、培养基性能测试方法 4.2 半定量方法 ——非选择性液体增菌培养基

32. 4、培养基性能测试方法 4.2 半定量方法 ——非选择性液体增菌培养基

33. 混合菌接种： 同时分别将目标菌菌悬液（与待测培养基接种同一稀释度）和非目标菌菌悬液（比待测培养基接种小10~100倍稀释度）1mL倾注平板，用作接种量计数 非目标菌接种：在待测培养基中接种等量混合菌试管中的非目标菌。 培养液接种： 混合菌培养液接种：用10μL接种环取1环培养后的混合菌培养液，划线接种到特定的选择性平板上； 非目标菌培养液接种：吸取10μL培养后的非目标菌培养液，涂布到非选择性平板上； 计算和结果解释 目标菌在选择性平板上的菌落应›10CFU 非目标菌在非选择性平板上的菌落数应‹100CFU 目标菌10CFU~100CFU 4、培养基性能测试方法 接菌量1mL 非目标菌1000CFU~5000CFU 4.2 半定量方法 ——选择性液体增菌培养基 则表示待测液体培养基的生长率良好

34. 例：亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC） 目标菌株：鼠伤寒沙门氏菌(10CFU~100CFU)； 非目标菌：大肠埃希氏菌(1000CFU~5000CFU) 铜绿假单胞菌(1000CFU~5000CFU); 混合接种：混合菌1mL接种待测培养基；分别将鼠伤寒沙门氏菌（10CFU~100CFU）和大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌（小10~100倍稀释度）1mL倾注平板，用于计数； 非目标菌接种：在待测培养基中接种等量混合菌试管中的非目标菌。 4、培养基性能测试方法 4.2 半定量方法 ——选择性液体增菌培养基

35. 4、培养基性能测试方法 例：亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC） 混合菌培养液的接种：用10μL接种环取1环培养后的混合菌培养液，划线接种到特定的选择性平板上； 非目标菌培养液接种：吸取10μL培养后的非目标菌培养液，涂布到非选择性平板上； 计算和结果解释 鼠伤寒沙门氏菌的菌落应›10CFU 大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌在非选择性平板上的菌落数应‹100CFU 4.2 半定量方法 ——选择性液体增菌培养基

36. 目标菌接种：取1mL目标菌（10CFU~100CFU稀释度）接种待测培养基，同时取1mL倾注平板，用作接种量计数；目标菌接种：取1mL目标菌（10CFU~100CFU稀释度）接种待测培养基，同时取1mL倾注平板，用作接种量计数； 非目标菌接种：取1mL非目标菌（1000CFU~5000CFU稀释度）接种待测培养基，同时取1mL（比待测培养基接种小10~100倍稀释度）倾注平板，用作接种量计数； 结果解释： 0 表示无混浊； 1 表示很轻微的混浊； 2 表示严重的混浊。 如需观察产气，记录小导管收集气体的体积比。 目标菌的浊度值应为2，产气应为1/3或以上； 非目标菌的浊度值应为0或1，无产气现象。 4、培养基性能测试方法 4.2 半定量方法 ——选择性液体计数培养基

37. 4、培养基性能测试方法 4.2 半定量方法 ——选择性液体计数培养基

38. 用1μL接种环取测试菌培养物在测试培养基表面划平行直线（细菌），或用接种针直接挑取斜面培养物点种接种（霉菌），按标准规定的培养条件培养。用1μL接种环取测试菌培养物在测试培养基表面划平行直线（细菌），或用接种针直接挑取斜面培养物点种接种（霉菌），按标准规定的培养条件培养。 结果解释 0 表示无生长； 1 表示微弱生长； 2 表示生长良好。 目标菌：得分为2，有典型的菌落外观、大小和形态； 非目标菌（选择性）：得分为0或1； 非目标菌（特异性）：有典型的菌落外观、大小和形态。 4、培养基性能测试方法 4.3 定性方法 ——非选择性、选择性固体计数和分离培养基

39. 用1μL接种环取工作菌悬液，接种到待测液体培养基中，培养。用1μL接种环取工作菌悬液，接种到待测液体培养基中，培养。 结果解释： 0 表示无混浊； 1 表示很轻微混浊； 2 表示严重混浊。 目标菌：浊度值为2； 非目标菌：浊度值为0或1； 4、培养基性能测试方法 4.3 定性方法 ——非选择性、选择性液体增菌和计数培养基 注：有时可以观察到微生物生长后聚集成细胞团，沉积在试管或瓶子底部， 发生这种情况时，小心振荡试管后再进行观察。

40. 用1μL接种环取一环工作菌悬液直接接种到待测培养基中，混匀，立即用10μL接种环取一环划平行线接种平板；用1μL接种环取一环工作菌悬液直接接种到待测培养基中，混匀，立即用10μL接种环取一环划平行线接种平板； 剩余已接种菌液的待测培养基置20℃~25℃放置45min，再用10μL接种环取一环划平行线接种平板； 按标准方法中规定的培养条件培养。 结果观察与解释 前后平板上目标菌的生长情况应均为良好。 4、培养基性能测试方法 4.3 定性方法 ——悬浮培养基和运输培养基

41. 纸片扩散法（定性测试） 平板制备： 倾注平板，厚度为4mm~5mm，使用前适当干燥； 质控菌：接种在血平板上复苏，纯度满意后，用于工作菌悬液制备； 工作菌悬液：指控菌株悬浮与TSB肉汤中，浊度为0.5麦氏标准（约1×108CFU/mL~2×108CFU/mL）； 接种：将工作菌悬液涂布与待测的MH平板上，贴上相应的抗生素纸片（每皿最多6片），平板翻转后培养。 注：调整菌悬液浊度与接种所有平板的时间不要超过15min。 结果观察与解释 在无反射黑色背景下，观察有无抑菌环。 结果解释参照附录F培养基质量控制标准。 4、培养基性能测试方法 4.3 定性方法——Mueller-Hinton血琼脂

42. 4.3.1 液体培养基 制备5McFrand浊度（约为109CFU/mL）的菌悬液； 接种：吸取0.05mL~0.08mL（约1~2滴）至待测培养基内； 按标准方法中规定的培养条件培养。 结果观察与解释 需加指示剂的实验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，在观察结果。 例：尿素培养基 +：阳性，奇异变形杆菌，培养基变玫红色； —：阴性，大肠埃希氏菌，培养基变黄色或不变色 4、培养基性能测试方法 4.3 定性方法——鉴定培养基 blank + —

43. 4.3.2 半固体培养基 用接种针条取新鲜质控菌株，穿刺接种待测培养基内； 按标准方法中规定的培养条件进行培养； 结果观察与解释 需加指示剂的实验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂， 在观察结果。 例：半固体培养基 +：阳性，单增李斯特氏菌 ，呈伞状或月牙状生长； —：阴性，蜡样芽孢杆菌，沿穿刺线生长。 4、培养基性能测试方法 4.3 定性方法——鉴定培养基 + —

44. 4.3.3 高层斜面培养基和斜面培养基 高层斜面（斜面与底层高约为：2:3）； 普通斜面（斜面与底层高约为：3:2）； 接种： 高层斜面：用接种针挑取新鲜质控菌株穿刺接种值琼脂高层，再在斜面上划“之”字形； 普通斜面：用接种针挑取新鲜质控菌株在斜面上划“之”字形； 结果观察与解释 需加指示剂的实验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂， 在观察结果。 4、培养基性能测试方法 4.3 定性方法——鉴定培养基

45. 质控菌株名称 产酸（黄）/产酸（黄） 斜面/底部 肠炎沙门氏菌（右一） 产碱（红）/产酸（黄） 福氏志贺氏菌 产碱（红）/产酸（黄） 弗氏柠檬酸杆菌（右二） 产酸（黄）/产酸（黄） 产H2S 大肠埃希氏菌（左二） + + - - + + + - 产气 4、培养基性能测试方法 4.3 定性方法——鉴定培养基 例：三糖铁琼脂 • 灭菌后制成高层斜面备用 • 空白对照（左一）：橘红色

46. 实验室试剂 1、按照试剂说明书进行实验； 2、参照标准进行结果观察与解释。 4、培养基性能测试方法

47. 5、测试结果的记录 制造商信息： 培养基制造商或供应商应按客户的要求提供培养基常规信息和相关测试菌株生长特性信息。 溯源性: 按照质量体系的要求，对所有培养基性能测试的数据归档，并在有效期内进行适当的保存。建议使用内部质量控制单进行文件记录并评价测试结果。

48. 产品 MSDS 产品质量检验报告

49. 5、测试结果的记录

50. 5、测试结果的记录