1 / 48

Mikroskopická technika

Mikroskopická technika. Vladimír Hampl, Veronika Sacherová, Pavel Němec. Co vás tu čeká?. Světelná mikroskopie (V. Hampl kol.) Speciální světelná a elektronová mikroskopie (V. Hampl a kol.) Základy obrazové analýzy (P. Němec a R. Černý)

aliza
Download Presentation

Mikroskopická technika

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Mikroskopická technika Vladimír Hampl, Veronika Sacherová, Pavel Němec

  2. Co vás tu čeká? • Světelná mikroskopie (V. Hampl kol.) • Speciální světelná a elektronová mikroskopie (V. Hampl a kol.) • Základy obrazové analýzy (P. Němec a R. Černý) • Počítání mikroskopických objektů (V. Sacherová a kol.)

  3. Co potřebujete na zápočet? • Minimálně 75% účast na praktiku • Odevzdání protokolů vypracovaných během cvičení • Nákresy dělejte velké, • Kreslete, co vidíte v mikrokopu a ne, co je v naší prezentaci, • nestínujte, nešrafujte.

  4. Doporučené studijní materiály • Naše webové stránky, kde jsou uvedeny prezentace k přednáškám i odkazy na literaturu: http://natur.cuni.cz/parasitology/parpages/mikroskopickatechnika/

  5. Něco navíc o světelné mikroskopii Knihy a skripta: • Dušan Matis a kolektív: Mikroskopická technika. Skriptum PřF Univerzity Komenského, 1993 • Jaromír Plášek: Nové metody optické mikroskopie. Skriptum Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy • Petr Smékal: Experimentální metody biofyziky II, Světelná a elektronová mikroskopie. Skriptum PřF Ostravské Univerzity, 1995 • Časopis Vesmír: • Mikroskopy, věda, průmysl... 1997/10, str. 576 • Mikroskopie (barevná dvojstrana uprostřed časopisu). 2004/3 • Jaromír Plášek: Proměny světelné mikroskopie ve 20. století. 2004/3, str. 146 A samozřejmě internet!!!Například stránky firem vyrábějících mikroskopy

  6. Světelná mikroskopie

  7. Krátký pohled do historie mikroskopování • 1590-1610 bratři Janssenové, první mikroskop • 17. -18. století A. Leeuwehoek • 1847 průmyslová výroba mikroskopů firmou Zeiss • 1911 C. Reichert, fluorescenční mikroskop s UV excit. • 1932 F. Zernick, fázový kontrast • 1955 Nomarski, diferenciální interferenční kontrast • 1968 rastrovací tandemový konfokální mikroskop • 1978 laserový konfokální rastrovací mikroskop

  8. Leeuwehoekův mikroskop Krátký pohled do historie mikroskopování

  9. Hookův mikroskop cca 1678 Krátký pohled do historie mikroskopování

  10. Světlo Způsoby popisu ve fyzice: Vlnový model (elektromagnetické vlnění) Kvantový model (proud fotonů) Geometrický model (světelný paprsek)

  11. Světlo • Rychlost (c) Ve vakuu 3 x 108 m/s • Vlnová délka (l) Vzd. mezi odpovídajícími si body sinusoidy • Amplituda (A) Největší odchylka sinusoidy od nulové hodnoty • Fáze (f) Udává v jaké části sinusoidy se vlnění nachází v urč. časovém úseku • Frekvence (f) Počet kmitů za jednotku času

  12. Světlo

  13. Interference a ohyb (difrakce)světla

  14. Interference a ohyb (difrakce)světla

  15. Interference a ohyb (difrakce)světla

  16. Odraz a lom světla úhel dopadu = úhel odrazu

  17. Odraz a lomsvětla řidší prostředí hustší prostředí = lom ke kolmici

  18. Odraz a lomsvětla = lom od kolmice řidší prostředí hustší prostředí

  19. Čočka Světelné paprsky šířící se z určitého bodu předmětu různými směry a dopadající na čočku se v obrazové rovině sbíhají opět do jednoho bodu a skládají tak ostrý obraz předmětu

  20. čočka Ohnisko (F) Optická osa ohnisková rovina rovina čočky ohnisková vzdálenost Čočka

  21. Čočka

  22. Skutečný a převrácený obraz Okulár, lupa Objektiv F  Zdánlivý obraz předmět mezi F a 2xF Předmět blíže než ohnisko (F) čočky Čočka – vznik obrazu F f F

  23. Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz zdánlivý a zvětšený obraz skutečný, převrácený a zvětšený obraz Vznik obrazu ve světelném mikroskopu

  24. Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz Vznik obrazu ve světelném mikroskopu

  25. Vznik obrazu ve světelném mikroskopu Fyzikální podstata vzniku obrazu v mikroskopu: Ernst Abbe (1873): poměrně složitá teorie, založená na využití Huygensova principu a interferenci transformovaných světelných vln procházejících preparátem

  26. Zvětšení světelného mikroskopu Zvětšení objektivu x zvětšení okuláru

  27. zvětšení numerická apertura Zvětšení světelného mikroskopu Maximální užitečné zvětšení Závisí na rozlišovací schopnosti objektivu

  28. numerická apertura Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu Vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body a = 0,61 l/ n x sina l - vlnová délka n – index lomu prostředí před objektivem a - polovina otvorového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu • Rozlišovací schopnost lze zvýšit: • snížením λ použití modrého světla (modrý filtr) • zvyšováním n   použití imerzního oleje

  29. světla Hlavní vypínač Ovlavač intenzity světla

  30. Preparát č. 1:Amoeba proteus Zvětšení:

  31. Preparát č. 2:NAKRESLIT!!!Paramecium caudatum Zvětšení:

  32. Typy objektů • Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně různé části světelného spektra, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné • Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami

  33. Barvení preparátů Nativní Živé buňky – nutno použít vhodný fyziol. roztok (savci a ptáci 0,85%, obojživelníci 0,64%, pufrovaný fyz. roztok PBS...) možno barvit vitálně karmín – potravní vakuoly mitotracker – mitochondrie metylénová modř – odlišení živých a mrtvých bb, živé se neobarví Trvalé Musí se fixovat – proti posmrtným změnám bb a tkání při zachování barvitelnosti denaturací bílkovin se zpevní a zakonzervují bb struktury • Roztěry • Suchý r. –fixace po zaschnutí (methanol), 2D objekty • Vlhký r. – fixace za vlhka (Bouin-Holland, sublimát, aj.), 3D objekty • Celkové preparáty • Kus tkáně • Malý živočich (fix. Alkohol 70-80% či formaldehyd 4% Typy barviv: pH kyselá: eosin, světlá zeleň, kyselý fuchsin, kyselina pikrová zásaditá:metylénová modř, toluidinová modř, bazický fuchsin neutrální: Giemsa-Romanowski, různé formy stříbra objekt barvení motolice a tasemnice:borax-karmín prvoci: Giemsa-Romanowski, protargol, hematoxylin tkáně: hematoxylin-eosin

  34. Nativní preparát:Tetrahymena pyriformiskarmín Trvalé preparáty: Tetrahymena pyriformisopálová modř Trypanosoma carassiGiemsa-Romanowski Tritrichomonas foetusGiemsa-Romanowski

  35. Trvalé barvení:Suchý roztěrTrypanosoma carassiTritrichomonas foetuspro barveníGiemsa-Romanowski

  36. Trvalé barvení Giemsa-Romanowski :Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu

  37. Preparát č. 3:Trypanosoma sp.

  38. Preparát č. 4:Tritrichomonas foetus

  39. Trvalé barvení Giemsa-Romanowski :Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu

  40. Preparát č. 5: Tetrahymena pyriformis Barvení: karmín

  41. Trvalé barvení Giemsa-Romanowski :Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu

  42. Trvalé barvení Giemsa-Romanowski:Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu

  43. Imerzní olej

  44. Imerzní olej • Předejdeme ztrátám světla • Do objektivu dopadne větší množství paprsků • Obraz obsahuje víc detailů

  45. Imerzní olej

  46. Preparát č. 6:NAKRESLIT!!!Tetrahymena pyriformis Barvení: opálová modř Zvětšení: cytostom řasinkové rýhy vakuola

  47. Preparát č. 7: NAKRESLIT!!!Trypanosoma carassi Barvení: Giemsa-Romanowski Zvětšení: jádro kinetoplast undulující membrána

  48. přední bičíky pelta jádro axostyl undulující membrána kosta volný zadní bičík Preparát č. 8:NAKRESLIT!!!Tritrichomonas foetus Barvení: Giemsa-Romanowski Zvětšení:

More Related