ФИРСОВ АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧ

1. ФИРСОВ АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧ С.Н.С. ЛАБОРАТОРИИ ЭКСПРЕССИОННЫХ СИСТЕМ И МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА РАСТЕНИЙ (БИОТРОН) ФИЛИАЛА ИБХ РАН • Тема исследований: «Разработка систем синтеза рекомбинантных белков на основе растительных экспрессионных платформ (биофарминг)», включая • Конструирование трансформационных векторов и экспрессионных кассет • Генетическая трансформация объектов исследований для получения трансгенных растений-продуцентов рекомбинантных протеинов. • Молекулярно-биологический анализ полученных трансгенных растений. • Анализ экспрессии целевых протеинов. • Основные направления проводимых исследований: • Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой или субъединицей В рицина в трансгенных растениях табака и ряски малой с целью разработки съедобных вакцин • Экспрессия сверхсладкого белка тауматина II в трансгенных растениях томата • Анализ устойчивости трансгенных растений к фитопатогенным вирусам

2. Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой в трансгенных растениях табака, трансформированных векторами pBIM130 и pBIM122 LB nos β-глюкуронидаза 35S CaMV nos NPT II nosRB ter prom ter prom А2 BamHI XbaI 84 кДа 84 кДа 84 кДа К-К+м1м2м3 М М130MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDPLVVAAPGGQSLMLRP~~~ KRWTGMNFGEKPQQGGKQ* М122MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSPGGQSLMLRP~~~ KRWTGMNFGEKPQQGGKQ* м1 м2 К- Мм3К+ Б1 Б2 84 кДа т1 т2 т3 К-М т1 т2 т4К1Мт6 т3 К1М Вестерн-блот анализ трансгенных растений табака, полученных после трансформации вектором pBIM122. Рис. Б1- с использованием антител к β-глюкуронидазе, рис. Б2 –антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной массы, К- - нетрансгенное растение, К1 - растение, трансформированное векторомpBI121, т1-т6- различные трансгенные линии. Красной стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза. Структура экспрессионных кассет векторов pBIM130 и pBIM122. Красным шриф-том показана аминокислот-ная последовательность пептида М2е Вестерн-блот анализ трансгенных растений табака, полученных после трансформации вектором pBIM130. Рис. А1- с использованием антител к β-глюкуронидазе, рис.А2 –антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной массы, К- - нетрансгенное растение, К+- трансгенное растение трансформированное вектором pBI121, м1, м2 и м3- различные трансгенные линии. Красной стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза. A1

3. Б 50 49 26 18 К+ 17 16 К- М 13 А 71 60 54 51 К+ 50 18 17 13 М В 72 70 69 К+ 66 65 К- М 54 51 Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой в трансгенных растениях ряски малой (Lemna minor), трансформированных вектором pBIM130. Вестерн-блот анализ трансгенных растений ряски, полученных после трансформации вектором pBIM130. А- с использованием антител к β-глюкуронидазе, Б и В-антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной массы, К- - нетрансгенное растение, К+- трансгенное растение, трансформированное вектором pBI121, цифрами обозначены различные трансгенные линии ряски. Стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза. Содержание слитого белка М2е- β- глюку-ронидаза в трансгенных растениях ряски малой , % от ОРБ.

4. Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с субъединицей В рицина (RTB) в трансгенных растениях табака и ряски малой, трансформированных вектором pBI-M2eRTB. K- L101 L 83 L60 L57 L48 L 41 L34 M K- M R+ T14 T7 T5 T4 T3 T2 T1 K- M T14 T7 T5 T4 T3 T2 T1 M2+ K- Вестерн блот анализ препаратов общего растворимого белка трансгенных линий табака с использованием антител к RTB (A) и M2e (Б). T1- T14- трансгенные линии, K- не транс-формированное растение табака, R+- рицин, экстрагированный из семян клещевины, M2+- пептид M2e экспрессированный в E. coli в слиянии с интеином (вектор pTYB11). Стрелки показывают слитый белок RTB-M2е. L12 M L88a L59 L46 L43 L36 L24a L7b К- Вестерн блот анализ препаратов общего растворимого белка трансгенных линий ряски с использованием антител к пептиду M2e. L- различные трансгенные линии, K- не трансформированные растения ряски, Стрелки показывают слитый белок RTB-M2е. Схематическая карта вектора pBI-M2eRTB. PR1 SP- сигнальный пептид PR1 белка табака, RTB- субъединица В рицина, M2e- N-концевой фрагмент белка М2 (30 а.к.), включающий пептид М2е, CBD- хитин-связывающий домен хитиназы А. А Б

5. Анализ экспрессии пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с субъедини-цей В рицина (RTB) в трансгенных растениях табака и ряски малой, трансформированных вектором pBI-M2eRTB. Б А А Б В Количественная асиалофетуин-ИФА препаратов общего белка из трансгенных растений табака и ряски. А. Концентрационная зависимость связы-вания рицина с иммобилизованным асиалофе-туином. В, С. Накопление слитого белка RTB-М2е-CBD в трансгенных растениях табака (В) и ряски (С). Использовались антитела к RTB, экви-валент RTB-М2е-CBD был вычислен исходя из графика концентрационной зависимости связыва-ния рицина с иммобилизованным асиалофетуином (А). К- нетрансформированное растение. Связывание слитого белка RTB-М2е-CBDс асиалофетуином, иммобилизованным на CNBr-активированной сефарозе (Donayre-Torres et al., 2009). Препарат общего белка из трансгенных растений табакапропускали через колонку с иимобилизованным асиало-фетуином. После промывки связанный с асиалофетуином слитый белок снимали глици-ном (рН4,0). А. Электрофорез двух фракций в 12,5% ПААГ. Б. Вестерн-блот анализ фракций этих же фракций с использованием антител к RTB. Стрелками показан слитый белок RTB-М2е-CBD.