实验十 显微镜直接计数技术

1. 实验十 显微镜直接计数技术 • 一、实验背景及目的： • 在微生物的研究和应用中，需要随时了解微生物的生长状态。 • 通过对微生物生长时期的数量的测定，即可了解微生物的生长状态，又可指导微生物的培养及应用。 • 如：典型生长曲线就是根据单细胞微生物的不同生长时期的细胞数量得到的、可以反映其群体生长规律的实验曲线。 • 1.学习、掌握显微镜直接计数方法和技术； • 2.巩固显微镜操作使用技术。 版权所有 未经作者同意 请勿使用

2. 实验十 显微镜直接计数技术 • 二、基本原理： • 显微镜直接计数技术可以对含菌样品所含的总菌数做出统计，是常用的、较快捷的一种统计微生物数量的方法和技术。 • 显微镜直接计数技术使用一特制的、专用的计数工具——血球计数板进行计数操作。 • 血球计数板上有四条槽，把计数板分为三个平台，两侧的平台用于搭放盖玻片，中间的平台又被分为两个较小的、每个平台上各有一个计数室的平台。如图10-1 版权所有 未经作者同意 请勿使用

3. 加样处 ＋ ＋ 实验十 显微镜直接计数技术 • 计数室是一个边长为1mm的正方形，其面积为1mm2。每个计数室被辅助线划分为25（中格）×16（小格）个小格，以方便计数。 • 图10-2为计数室（红色双线围成的即为由25个中格组成的计数室。） 图10-1 计数板俯视图 版权所有 未经作者同意 请勿使用

4. 实验十 显微镜直接计数技术 图 10-2 计 数 室 版权所有 未经作者同意 请勿使用

5. 实验十 显微镜直接计数技术 • 两侧平台上搭放盖玻片后，中间的计数室平台与盖玻片间有0.1mm的缝隙，即两个计数室的容积分别为0.1mm3，每个计数室的加样量均为0.1mm3。计数操作时，就是统计了0.1mm3样液中的微生物细胞数，再由下式得每毫升样液的含菌量： • 菌数/ml =A/5×25×10×1000×B=50000·A·B • 式中：A：计数室四个角上的四个中格和中间的一个中格共计五个中格中的微生物细胞数之和； • 计数时，一般不会统计400个小格中的菌数，而是选择有代表性的格作计数； 版权所有 未经作者同意 请勿使用

6. 实验十 显微镜直接计数技术 • 25：25个中格； B：样液的稀释倍数； • 10、1000：单位换算倍数； • 血球计数板有不同的规格，如：25×16和16×25，均为400个小格。本实验采用25×16的血球计数板。 • 血球计数板一般用于酵母菌和霉菌的孢子计数，不适于细菌计数。 • 血球计数板是精密的实验工具，清洗和作消毒处理时，不得使用硬质的刷子或对玻璃有腐蚀作用的药剂。 版权所有 未经作者同意 请勿使用

7. 实验十 显微镜直接计数技术 • 三、实验材料： • 1.实验菌种及培养基：酿酒酵母菌细胞稀释液； • 2. 实验设备及器材：恒温培养箱；恒温干燥箱；高压蒸汽灭菌锅；显微镜；酒精灯；接种环；滴瓶；试剂瓶；双层瓶；镊子；载玻片；φ90mm培养皿；500ml标本缸；15×150试管；火柴（或打火机）；吸水纸；镜头纸；棉花； 版权所有 未经作者同意 请勿使用

8. 实验十 显微镜直接计数技术 • 四、实验步骤和方法 • 1.检查、清洗计数板：显微镜下检查计数板和计数室内有无污物。若有，用清水轻轻冲洗，再用吸水纸轻轻吸取水分，干燥，待用； • 计数板上有污物或水分会影响计数结果的准确性。 • 2.加盖片：将合适大小的盖玻片搭放在两侧的平台上； 版权所有 未经作者同意 请勿使用

9. 实验十 显微镜直接计数技术 • 3.加样：加样前，先将样液充分混合均匀；用无菌小滴管取样液，滴加在盖玻片与计数室平台交界处，由毛细作用，样液吸入计数室；见图10-1； • 4.静置：静置5分钟左右，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移； • 5.统计、计数：在显微镜下找好需计数的方格，开始计数。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。 版权所有 未经作者同意 请勿使用

10. 图10-3 实验十 显微镜直接计数技术 • 本实验中暂规定：计上不计下，计左不计右，即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见图10-3：即本格中计数细胞为3个。 版权所有 未经作者同意 请勿使用

11. 实验十 显微镜直接计数技术 • 同一个样品，应作两次计数，取平均值； • 6.计算样品所含总菌数：根据统计、计数结果，计算样品所含的总菌数； • 7.清洗处理计数板：实验完成后，及时按 规定清洁处理技术板。 • 本实验所用计数板，可用清水清洁处理后，吸干水分，妥善保存。 版权所有 未经作者同意 请勿使用

12. 实验十 显微镜直接计数技术 • 五、实验结果： • 1.将统计、计数结果填入下表： 版权所有 未经作者同意 请勿使用

13. 实验十 显微镜直接计数技术 • 2.影响显微镜直接计数结果的因素有哪些，如何避免？ • 3. 整理实验设备，清理实验台。 版权所有 未经作者同意 请勿使用