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台灣養殖魚類鏈球菌感染症 陳稚姍、徐基新 國立中山大學海洋資源學系. 報告學生：蕭佑虔 指導老師：古鎮鈞. 前言. 台灣養殖魚類之鏈球菌感染症 ( Sterptococcosis ) 為常見之疾病， 在魚類有急增之趨勢 。. 淡水常見魚種：吳郭魚、大嘴鱸、香魚、鱒魚及鯰魚； 海水常見魚種：金目鱸、臭都魚、花身雞魚、烏魚、 豆仔魚、銀紋笛鯛、石斑魚及多種熱帶 魚。 ( 邵等， 1996).
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台灣養殖魚類鏈球菌感染症 陳稚姍、徐基新 國立中山大學海洋資源學系 報告學生：蕭佑虔 指導老師：古鎮鈞
前言 台灣養殖魚類之鏈球菌感染症(Sterptococcosis)為常見之疾病，在魚類有急增之趨勢。 淡水常見魚種：吳郭魚、大嘴鱸、香魚、鱒魚及鯰魚； 海水常見魚種：金目鱸、臭都魚、花身雞魚、烏魚、 豆仔魚、銀紋笛鯛、石斑魚及多種熱帶 魚。(邵等，1996)
近二十年來在台灣及其他國家如日本、美國、澳洲、南非、新加坡等國家之多種養殖魚類因受其感然而導致死亡(Kitao et al，1981；Tung et al，1985;Boomker et al，1979;Foo et al，1985;Humphrey et al，1987)。
發生鏈球菌感染症常發生在較高水溫(Nguyen et al，2001)，此情況與台灣南部養殖魚鏈球菌感染症常發生於夏季高水溫，再加上飼養環境密度及緊迫因子，而造成養殖業者經濟上嚴重損失。所以鏈球菌感染症是台灣目前在養殖魚類上最重要的細菌性疾病之ㄧ(董等，1987)。
由罹病之鱸魚、吳郭魚、石斑魚及四絲馬拔午仔魚表體及體內所分離出來的鏈球菌進行以下研究：由罹病之鱸魚、吳郭魚、石斑魚及四絲馬拔午仔魚表體及體內所分離出來的鏈球菌進行以下研究： 1 行態 2 生理 3 生化之特性 4 對魚類之病原性 5 分類上之地位 6 病理學之特徵
材料及方法 1 病材收集 臨床症狀發病魚肢體變黑、異常游泳姿，或倦躺於池邊之魚隻。
2 細菌分離 以無菌操作方式分別取出病魚臟器(肝、脾、腎、心、眼等) 釣菌培養於BHI 腦心浸出物培養基(brain heart infusion agar,Difco)及血液培養皿(blood agar platr)上 於28℃下經24 – 48小時培養並觀察菌落的情況(蔡，1996；劉，1996)。
3 細菌型態及生理學特性之鑑定 3–1形態 將細菌固定於乾淨載玻片，以革蘭氏染色法及臟器塗抹經劉氏染色後，於光學顯微鏡下觀察期形態、大小及染色性。 3–2 Catalase及Oxidase試驗 將BHI上菌落做Catalase及Oxidase後均呈現陰性。
3–3生長溫度試驗 接種少許細菌於3ml試管中，分別於10 ℃ 、28 ℃ 、45 ℃，觀察24 - 72小時，若BHI呈現渾濁即可判定菌株生長溫度條件。 3–4鹽度耐受性試驗 分別於0%、1.5%、3%及6.5%NaCl的BHI ，接種少許細菌，觀察24 - 72小時，若BHI呈現渾濁即可判定菌株鹽度耐受性試驗。 3–5 API 20 STREP system 生化鑑定法 以市售之套裝商品API 20 STREP system (Bio Mereux z,France)進行鑑定。
4 組織病理學檢查 採集樣本 浸泡10%中性福馬林固定液中 一系列不同濃度酒精中逐步脫水 組織精石蠟完全浸透包埋。包埋好組織塊以刀片修整後，即可固定於組織切片機上，切成3 - 5μm厚之薄片。 切好之薄片，先經約40 ℃水溫展開後至於載玻片上風乾。再以蘇木紫和伊紅(hematoxlin&eosin;H&E)染色，染色完已封片膠封片，最後以顯微鏡下觀察並拍照
5 菌體核酸DNA之萃取及16S r DNA 萃取菌株之染色體DNA，並以分光光度計定量成0.1μg/μl 以Weisburg等人(1991)所設計之16S conserved sequence 為引子進行PCR反應 將PCR產物由膠體回收以後以Qiagen 之gel extraction kit進行PCR產物回收。
結果 1 採樣結果 體表多處出血病灶，部分眼球突出、角膜混濁、肝臟充出血、鰓蓋內充出血、鰓絲潮紅、腹水、腹膜炎、脾臟腫大等病變。 2 細菌分離 於BHI及BAP上培養，在28℃下48小時BHI上出現直徑約1mm半透明菌落，BAP上出現直徑1.5-2mm菌落及β-溶血。
3 細菌形態及生理學特性 9株分離株以革蘭氏染色均為陽性菌球；劉氏染色菌體球狀並相連成串( 圖1 )。11株分離株(含2株標準菌株；Streptococcus agalactiae 及Streptococcus iniae)均可在28 ℃下培養，但9株分離株一可在10 ℃及45 ℃下培養( 表一 )。 11株分離株可於 0% 與 1.5% NaCl 之 BHI 中生長，其中有8株可在 3% NaCl 之 BHI 中生長，而均無法在 6.5% NaCl 之 BHI 中生長( 表2 )。
4 組織病理學觀察 肝臟會出現細胞空泡、壞死，部分肝臟細胞腫脹，表面覆有大量炎症細胞、纖維滲出物及球形菌體( 圖2、圖3)。 淋巴細胞減少消失，而原有淋巴細胞被類上皮細胞取代。並可見類上皮細胞具有吞噬菌體的情況( 圖4、圖5 )。
部份心外膜細胞有鏈球菌浸潤及壞死現象；並有少許纖維素產生，心肌有炎症細胞浸潤，肌肉呈岑克氏壞死及均質樣變化( 圖6、圖7)。 腎小管上皮脫落、變性、壞死及細胞質均質化( 圖8、圖9 )。鰓充血現象何部分鰓上皮細胞剝離，並於二級鰓薄板微血管腔中出現球形菌體( 圖10、圖11 )。
5 DNA 的萃取與PCR檢測結果 經PCR後所得之 DNA 片段大小約為 1.6 kb ( 圖12 )。由並於分離到的9株細菌之 DNA Sequencer (Perkin-Elmer,Wellesley,MA,USA) with ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit進行定序，並與Genbank 中最相似菌株進行比對，結果為Streptococcus agalactiae及Streptococcus iniae ( 表3 )。
討論 養殖魚類之鏈球菌感染症( Srtreptococcosis )導致全世界多種養殖魚類死亡。 在臨床症狀及剖檢上可見體表多處出血病灶、眼球突出或角膜混濁、肝臟充出血等病徵，卻無法與同是革蘭氏陽性菌的 Enterocoous spp.及 Lactococcus spp.區別。
鏈球菌感染症在組織病理變化有兩項病變，一項是在患魚的腎臟、脾臟及胃腸道出現明顯廣泛性、瀰漫性的病灶區，另一項是腹腔出現局部化膿及局部炎症反應，這兩種病變均能在病灶區出現肉芽腫。鏈球菌感染症在組織病理變化有兩項病變，一項是在患魚的腎臟、脾臟及胃腸道出現明顯廣泛性、瀰漫性的病灶區，另一項是腹腔出現局部化膿及局部炎症反應，這兩種病變均能在病灶區出現肉芽腫。 雖然 Enterocoous spp.臨床症與 Srtreptococcosis 非常相似，因Enterocoous spp. 沒有上述二項主要病變所能區別。
實際上經由組織病理學變化來區別各種感染症之菌種具有很大的困難性，因為有許多病變是不具有特異性。實際上經由組織病理學變化來區別各種感染症之菌種具有很大的困難性，因為有許多病變是不具有特異性。 綜合前述之實驗研究結果，由生理生化特性及API 20 STREP system鑑定的結果無法正確且快速的鑑定Streptococcus agalactiae及Streptococcus iniae，故更進一步利用 16S rDNA 定序來鑑定、診斷。
今後將更進一步製作核酸探針及特異性引子對，利用核酸探針偵測 Streptococcus 在魚體內的分佈路徑，並能追溯病原可能來源或傳播路徑，能對流行病學研究提供一項有效的工具。 運用特異性引子對建立快速鑑定、診斷鏈球菌感染症，以PCR技術檢測分析作為監測現場是否感染的系統模式，希望在最短的時間內檢測出病原，以減少養殖現場所造成損失。
報告結束!!! 多謝指教!!!
