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综合化学实验 —— 配位化学和生物无机化学部分

综合化学实验 —— 配位化学和生物无机化学部分. 指导教师: 毛宗万 刘文婷 黄华珍 cesmzw@mail.sysu.edu.cn 997160366@qq.com huanghzh @mail.sysu.edu.cn. 氨基酸铜配合物的模板合成 及其对质粒 DNA 的切割. 中山大学化学与化学工程学院 2013 年 09 月. http://ce.sysu.edu.cn/comlab/. 实验内容. 实验 1 氨酸铜配合物的合成和表征 模板合成 IR 光谱表征 自由基的 UV 光谱检测 实验 4 DNA 提取及其与氨酸铜配合物的作用

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综合化学实验 —— 配位化学和生物无机化学部分

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  1. 综合化学实验——配位化学和生物无机化学部分综合化学实验——配位化学和生物无机化学部分 指导教师:毛宗万刘文婷黄华珍 cesmzw@mail.sysu.edu.cn 997160366@qq.com huanghzh@mail.sysu.edu.cn 氨基酸铜配合物的模板合成 及其对质粒DNA的切割 中山大学化学与化学工程学院 2013年09月 http://ce.sysu.edu.cn/comlab/

  2. 实验内容 实验1 氨酸铜配合物的合成和表征 • 模板合成 • IR光谱表征 • 自由基的UV光谱检测 实验4 DNA提取及其与氨酸铜配合物的作用 • 琼脂糖凝胶电泳 • 凝胶成像 总学时:15 学时 地点:丰盛堂212室

  3. DNA结构及其断裂方式 自由基机理 自由基进攻糖环或碱基,导致氧化破坏 酯水解机理 亲核试剂进攻磷原子,发生亲核取代反应 Ⅰ 超螺旋DNA Ⅱ 缺刻型DNA Ⅲ 线型DNA 酯水解机理优于自由基机理

  4. DNA的自由基断裂 • 配合物与未受损的DNA表面结合并诱导其断裂 • 进一步在新的断裂处结合 • 断裂反应 • 互补链的断裂

  5. 实验背景——模拟博莱霉素 在天然物质中,由5 个氨基酸、2 个六碳糖和1 个氨基侧链构成的博来霉素(bleomycin)可导致DNA链的断裂,从而作为一族广谱抗菌抗肿瘤药物。

  6. 博莱霉素的活性中心 导致DNA链的断裂原因是由于博来霉素分子的一部分是铁或铜的配合物,这类配合物能够产生导致DNA链断裂的自由基。 CuP-3A的配位结构示意图

  7. 博莱霉素的模型化合物 • Pamatong, F. V.; Detmer. C. A., III; Bocarsly, J. R.; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5339. • Detmer. C. A., III; Pamatong, F. V.; Bocarsly, J. R.; Inorg. Chem., 1996, 21, 6292. Cu2+ + e- = Cu+ Cu+ + H2O2 = Cu2+ + OH- + OH

  8. 氨基酸铜化合物的合成路线

  9. 模板反应的化学机理

  10. 化合物1的红外光谱 (COO-) (NO2) (NO2) (COO-)

  11. 化合物2的红外光谱 (NH2) (COO-) (COO-)

  12. 氢氧自由基的形成和UV光谱检测 由于罗丹明B可与HO·迅速反应,并在553nm有强吸收,因此我们可以利用此反应采用分光光度法检验HO·的生成。

  13. 琼脂糖凝胶电泳 • 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 • 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 • 根据琼溶解温度,把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 • 低熔点琼脂糖熔点为62~65℃,溶解后在37℃下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片段的回收,质粒与外源性DNA的快速连接等

  14. 凝胶浓度选择——琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围凝胶浓度选择——琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围

  15. 电泳缓冲液 • 常用三种缓冲液 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE) • TBE与TPE:缓冲容量高,DNA分离效果好,但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高,容易使DNA沉淀 • TAE:缓冲容量低,但价格较便宜,因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子,从而抑制DNA酶的活性,防止PCR扩增产物降解

  16. 核酸电泳的指示剂 • 指示剂:溴酚兰、二甲苯青 • 溴酚兰:在碱性液体中呈紫兰色,电泳中,溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 • 二甲苯青:水溶液呈兰色,电泳时,其迁移速率与双链线性DNA大致相当

  17. 核酸电泳的染色剂——溴化乙锭 • 一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下,发出红色荧光 • 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB,有时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10~15min • 琼脂糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般>5ng • 溴化乙锭太多,凝胶染色过深,核酸电泳带看不清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察 ethidium bromide,EB

  18. DNA断裂的凝胶电泳图 Ⅰ 超螺旋DNA Ⅱ 缺刻型DNA Ⅲ 线型DNA

  19. 电泳实验装置 • 电泳仪(普通) • 电泳槽(水平平板) • 灌胶模具等

  20. 电泳实验方法 • 洗净电泳槽,架好梳子 • 配制琼脂糖凝胶及倒胶 • 上样与通电 • 结果观察

  21. 配制琼脂糖凝胶及倒胶 • 0.5×TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中,称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化,冷却至60℃(需要时可加入EB),倒入电泳槽中,待凝固。 • 向电泳槽中倒入0.5 × TBE,其量以没过胶面2mm为宜,小心移去梳子(如样品孔内有气泡,应除去)

  22. 上样与通电 • 在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液,混匀后,加入样品孔内 • 接通电源,一般红色为正极黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负),电压为1 — 5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算) • 根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳。一般 电泳条件为:电压 90V,时间 40min。

  23. 结果观察和记录 • 紫外仪上观察电泳带及其位置 • 拍照 • 进一步使用软件对光密度进行分析

  24. 合成实验要点 • 检查回流装置是否保持干燥 • 硝酸铜在称量前用滤纸吸干固体表面潮解的溶液 • 合成实验中前半个小时注意观察反应混合物的颜色变化,亮蓝色或紫蓝色为反应正常 • 实验中化合物合成与DNA断裂实验需交叉进行, DNA断裂所需的配合物由准备室提供 • 若硝基还原使用了较多溶剂,需使用旋转蒸发器除去多余溶剂 • 凝胶电泳照相需戴手套

  25. 实验技术和方法 • 模板合成——大环化合物的合成方法(212室) • 旋转蒸发器——除去多余溶剂(212室) • 红外光谱——化合物结构表征 (210室) • 紫外可见光谱——跟踪罗丹明B与氢氧自由基的反应 • 凝胶电泳——切割DNA (317室) • 凝胶成像分析——检测DNA断裂状况(317室)

  26. 实验要求 • 做好预习(查阅药品及溶剂的性质、羧基和硝基的IR特征峰值、光谱技术原理及思考题预习等) • 实验中做好实验记录及相关计算(包括实验现象、产品重量、产率等) • 做好每一次测试,并打印结果 • 实验结束时提交最终产品和测试图谱供检查 • 对实验结果作简要讨论 • 下一次实验提交本次实验报告 • 遵守实验规则,严禁违规操作,做好清洁值日

  27. 参考书 (配位化学、生物无机化学、生物技术) • V. V. Gerbeleu, V. B. Arion, J. Burgess, “Template synthesis of macrocyclic compounds”, WILEY-VCH verlag GmbH, 1999. • 计亮年,黄锦汪、莫庭焕等编著,《生物无机化学》(第二版),中山大学出版社,2001。 • 杨频,高飞编著,《生物无机化学》,科学出版社,2002。 • F.奥斯伯, R.布伦特, R.E.金斯顿 等, 《精编分子生物学实验指南》,1998年6月第1版。

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