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Genetica medica ADI-1 genetica online e clinica

Genetica medica ADI-1 genetica online e clinica. barbara.pasini @ unito.it Dip. di Genetica Biologia e Biochimica Genetica medica oncologica ASO S. Giovanni Battista - Torino IRCC - Candiolo. Le malattie genetiche :.

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Genetica medica ADI-1 genetica online e clinica

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Presentation Transcript

  1. Genetica medicaADI-1genetica online e clinica barbara.pasini@unito.it Dip. di Genetica Biologia e Biochimica Genetica medica oncologica ASO S. Giovanni Battista - Torino IRCC - Candiolo

  2. Le malattie genetiche : • Malattie causate in modo esclusivo o parziale da un difetto del patrimonio ereditario: • difetto nel numero o struttura dei cromosomi • -> malattie cromosomiche • difetto nella struttura o funzione di un gene • -> malattie geniche(monogeniche) • (mutazioni del DNA nucleare e mitocondriale) • coinvolgimento di una serie di geni localizzati in una stessa regione genomica (riarrangiamento) • -> malattie genomiche

  3. Le malattie genetiche : • effetto di modificazioni chimiche e strutturali del DNA in grado di alterare l’espressione di un gene o di un gruppo di geni • -> malattie epigenetiche • (difetti di imprinting) • effetto dell’interazione tra geni e ambiente • -> malattie multifattoriali o complesse

  4. + 179 March 20, 2005

  5. + 186 March 24, 2004

  6. April 19, 2006 March 20, 2005 March 24, 2004

  7. diagnosi corretta gestione clinica identificazione dei portatori identificazione dei non portatori ricerca Perché occuparci di questi casi da un punto di vista genetico ? • tumori giovanili, multipli, bilaterali fanno sospettare una predisposizione • i soggetti già malati potrebbero sviluppare altri tumori • altri membri della famiglia potrebbero ammalarsi • parenti sani ma preoccupati di potersi ammalare in futuro potrebbero non avere ereditato il difetto genetico • la “causa” genetica (biochimica) di una malattia potrà in futuro essere corretta ?!

  8. Ricerca basata sul “sintomo” Feocromocitoma famigliare Feocromocitoma + angioma midollare • National Center for Biotechnology Information NCBI : http://www.ncbi.nlm.nih.gov • Pubmed , OMIM • > VHL, RET, SDH-B, SDH-C, SDH-D • Gene Test http://www.geneclinics.org/ • > Gene Review • Cancer Prone Diseases http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/

  9. MEN2 parathyroid hyperplasia medullary thyroid carcinoma MEN1 pheochromocytoma para- ganglioma neuroendocrine pancreatic tumors retinal angiomas CNS haemangioblastomas renal cell carcinomas pituitary adenoma duodenal gastrinomas carcinoids exc. VHL SDH genes

  10. Predisposizioni ereditarie allo sviluppo delfeocromocitomae paragangliomi extra-surrenalici Casi di feocromocitoma isolato , non-sindromico (surrenalico , extra-surrenalico) • 11% VHL (per lo più mutazioni missenso) • 5% RET (per lo più mutazioni esoni 11 e 13) • 4.5% SDHB • 4% SDHD Tot 24% (70% <10 yr, 51%< 20 yr; 39% < 30 yr, 27% < 40 yr, 18%< 50 yr) (80% se multifocale)

  11. Paziente di anni 43. - a 42 anni: feocromocitoma bilaterale - non altre manifestazioni cliniche di VHL (fondo oculare negativo, RM encefalo e midollo negativa, TC addome negativa) Genitori deceduti: -madre a 71 anni per emorragia cerebrale -padre a 65 anni per coma diabetico Una sorella deceduta a 31 anni per complicanze post-operatorie di intervento neuro-chirurgico per “angioma midollare”.

  12. Impostazione del test genetico • Ricerca di mutazioni e delezioni gene VHL • Se negativo, • analisi RET e SDH-B, SDH-C, SDH-D Acquisizione della sequenza genomica del gene VHL (Entrez Gene, Ensemble: www.ensembl.org) • ricerca di mutazioni puntiformi: PCR e sequenza • ricerca di delezioni genomiche

  13. Denaturazione95°C Appaiamento inneschi Sintesi del DNA 72 °C(Taq polimerasi) Ciclo 1 Sintesi del DNA Ciclo 2 PCR Appaiamento inneschi

  14. N° cicli 1 3 10 15 20 25 30 N° sequenze bersaglio 0 2 256 8192 262.144 8.388.608 268.435.456 PCR : Reazione a Catena della Polimerasi Per l’analisi di una digestione con enzimi di restrizione tale da poter essere visibile in elettroforesi occorre ~1g di DNA. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni. In 1  g di DNA genomico, una copia singola di un esone (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA. Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8  g in 25 cicli e 27  g in 30 cicli.

  15. Sequenziamento del DNA (1):strutture dei nucleotidi

  16. Sequenziamento del DNA (2): il metodo di Sanger Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide * Indica il primer (lungo 15 nucleotidi) ** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta

  17. pozzetti autoradiogramma Sequenziamento del DNA (3): il metodo di Sanger Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l’ alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (estremità 5’) mentre il nucleotide T è all’estremità 3’.

  18. 361G>A Caso indice: sequenza “senso” (forward) Caso indice: sequenza “anti-senso” (reverse) 541 CACAGCTACCGAGGTCACCTTTGGCTCTTCAGAGATGCAGGGACACACGATGGGCTTCTG 110 -H--S--Y--R--G--H--L--W--L--F--R--D--A--G--T--H--D--G--L--L-

  19. codifica mutazione c.365G>A (p.D121N) GAT>AAT: Asp121Asn Acido Aspartico -> Asparagina aa acido aa polare COOH | 2HN -- CH | CH2 | COOH COOH | 2HN -- CH | CH2 | CO--NH2 DB SNPs: Segnalato in precedenza SNP D121G senza info DB mutazioni: The Human Gene Mutation Database : http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html -> report 1994 D121G in un paz. con feocromocitoma

  20. VHL protein beta-domain 7 stranded b sandwich: aa 63-154 (HIF1a binding: aa 67-117) H4: aa 193-204 Linker: aa 189-194 alpha-domain aa 155-192 H1 – H2 – H3 Linker: aa 154-156 polar interface between a and b domains Stebbins CE et al Science 1999

  21. VHL – a b interface Polar interface between alpha and beta domain Hydrogen bonds involving: a amino acids: H3 Asp187, Leu188 H1 Glu160, Arg161, Gln164, Arg167 b amino acids: L6 Asp121, Thr124, Asp126 L2 Arg82 Stebbins CE et al Science 1999

  22. Feocromocitoma non sindromico • giovanile in due fratelli • Programma: • ricerca di mutazioni RET e SDH • se negativo: analisi VHL

  23. 467A>C Caso indice Madre 661 AATATCACACTGCCAGTGTATACTCTGAAAGAGCGATGCCTCCAGGTTGTCCGGAGCCTA 150 -N--I--T--L--P--V--Y--T--L--K--E--R--C--L--Q--V--V--R--S--L-

  24. COOH | 2HN -- CH | CH2 | | OH codifica mutazione c.467A>C (p.Y156S) TAT>TCT: Tyr156Ser Tirosina -> Serina aa idrofobico aromatico aa polare “sottile” polare COOH | 2HN -- CH | CH2--OH DB SNPs: NON segnalati SNPs in 156 DB mutazioni: The Human Gene Mutation Database : http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html -> 3 report anche recenti di mutazioni: Y156D, Y156N, Y156C

  25. VHL - Elongin C interface Most relevant contact: Leu158 – Cys162 – Arg161 Hydrogen bonds: Arg82 – Arg161 – Lys159 Stebbins CE et al Science 1999

  26. Effetto delle mutazioni missenso • cambiamento aminoacidico +- conservativo • frequenza nella popolazione generale • segregazione nell’ambito della famiglia • effetto prevedibile sulla struttura/funzione della proteina (modeling) • conservazione nell’evoluzione • test funzionale (ev. second hit)

  27. SIFTSorting Intollerant From Tolleranthttp://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html D121N con nematodi 0.13 senza nematodi 0.00 Y156S con nematodi 0.26 senza nematodi 0.22 Y156D con nematodi 0.13 senza nematodi 0.11 Y156N con nematodi 0.20 senza nematodi 0.17 Y156C con nematodi 0.11 senza nematodi 0.09

  28. Inattivazione di geni onco - soppressori : perdita di funzione • Geni RECESSIVI • entrambi gli alleliinattivati : • delezioni o riarrangiamenti • cromosomici • mutazioni puntiformi • iper - metilazione 2 mutazioni somatichetumore sporadico 1 costituzionale + 1 somaticatumore ereditario

  29. Gene onco-soppressore Rb Alleli Rb normali Mutazione germinale mutazione somatica mutazione somatica mutazione somatica Retinoblastomi multipli bilaterali ad insorgenza precoce Retinoblastoma unico mono-laterale

  30. Inattivazione di geni onco - soppressori con perdita di eterozigosità (LOH) Allele 1 5 8 Allele 2 3 6 Prima mutazione: puntiforme Allele 1 5 8 Allele 2 3 6 seconda mutazione: delezione Allele 8 Allele 2 3 6

  31. Inattivazione di geni onco - soppressori con perdita di eterozigosità (LOH) Allele 3 1 5 8 Allele 3 2 3 6 Allele 1 4 6 8 Allele 3 2 3 6 Allele 5 3 4 6 Allele 3 2 3 6 Tessuto sano Allele 8 Allele 3 2 3 6 Allele 1 8 Allele 3 2 3 6 Allele 5 3 Allele 3 2 3 6 Tessuto tumorale Loci studiati: 1 2 3 4 Caso 1 ni - - + Caso 2+ - - + Caso 3++ - ni Sede del gene onco-soppressore

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