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分子信标技术

分子信标技术. 李舒艳 200425038. 分子信标简介 分子信标的结构 分子信标的工作原理 分子信标的应用 前景与展望. 分子信标简介. Tyagi 和 Krammer 于 1996 年首次建立，目的是在液相中定量测定靶标序列。 基于荧光共振能量转移（ FRET ）设计的一种新型荧光标记核酸探针 特殊的发夹结构使得其具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别性强的特点 广泛应用于分子生物学和生物技术. 分子信标的结构. 经典分子信标结构包括： （ 1 ）环状区（长度 15 ～ 30 个碱基的序列，能与目标分子特异结合）

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分子信标技术

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Presentation Transcript

  1. 分子信标技术 李舒艳 200425038

  2. 分子信标简介 • 分子信标的结构 • 分子信标的工作原理 • 分子信标的应用 • 前景与展望

  3. 分子信标简介 • Tyagi和Krammer于1996年首次建立，目的是在液相中定量测定靶标序列。 • 基于荧光共振能量转移（FRET）设计的一种新型荧光标记核酸探针 • 特殊的发夹结构使得其具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别性强的特点 • 广泛应用于分子生物学和生物技术

  4. 分子信标的结构 经典分子信标结构包括： （1）环状区（长度15～30个碱基的序列，能与目标分子特异结合） （2）信标茎杆区（长度为5～8个碱基的互补序列，使得形成发夹结构） （3）5端的荧光基团（徳克萨斯红、荧光素等染料） （4）3端的猝灭基团（DABCYL ）

  5. 环状区 猝灭基团 茎杆区 荧光基团 首例分子信标结构示意图

  6. 分子信标工作原理 无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近，发生FRET，荧光猝灭，荧光背景极低。 加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳定的双链杂交体，使得荧光基团和猝灭基团距离增大，阻止了FRET的发生，荧光恢复。

  7. 影响分子信标的因素 • 荧光—猝灭基团间的距离的影响 • 环境pH值的影响 pH过高时，茎干区碱基对之间的稳定结合被破坏，分子信标变性，荧光基团与猝灭基团分开产生荧光 E：FRET效率 R：荧光给体与受体之间的距离

  8. 温度对分子信标的影响

  9. 波长转移分子信标

  10. 表面固定分子信标

  11. 量子点分子信标

  12. 分子信标的应用 • 核酸的检测分析 • 实时定量PCR测定靶标浓度 • 活体内核酸的动态检测 • 同时检测多个靶核苷酸 • 检测双链DNA • 研究DNA—蛋白质的相互作用 • 用于核酸酶的研究 • 用于研究DNA——蛋白质的相互作用 • 用作生物芯片和生物传感器

  13. 双链DNA检测 PNA与双链DNA互补链结合时可以取代非互补链,使之解链以单链的形式存在,形成P-环结构。特定序列的DNA或PNA分子信标可以与双链DNA的变性部分结合,分别形成PD-或PP-环型化合物,分子信标结构被破坏,出现荧光响应。最近的实验结果表明,利用茎-环结构的DNA分子信标或无茎的PNA分子信标可以实时检测PNA与双链DNA的结合位点 Demidov, V.V. (2001) PD-loop technology:PNA openers at work. Expert Rev. Mol. Diagn. 1, 343–351

  14. Human osteosarcoma cell nucleus (U2OS cell line) vitally injected with a Cy3-labelled probe specific for chromosomal telomeric repeat sequenes. Note that some spots are relatively large suggesting association or clustering of multiple telomeres. Molenaar C et,el. Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes. EMBO J 2003,24:6631-6641.

  15. Whitcombe设计的一种将ＰＣＲ引物与分子信标相结合的蝎状引物荧光探针。在该探针中,ＰＣＲ引物与分子信标之间有一间隔臂,使ＰＣＲ反应不能往分子信标方向延伸。在ＰＣＲ过程中,非特异扩增产物不会产生荧光信号,而当特异性扩增产物生成时,分子信标将立即与其进行分子内杂交,同时发出荧光信号。Whitcombe设计的一种将ＰＣＲ引物与分子信标相结合的蝎状引物荧光探针。在该探针中,ＰＣＲ引物与分子信标之间有一间隔臂,使ＰＣＲ反应不能往分子信标方向延伸。在ＰＣＲ过程中,非特异扩增产物不会产生荧光信号,而当特异性扩增产物生成时,分子信标将立即与其进行分子内杂交,同时发出荧光信号。

  16. Working mechanism of the fluorophore–quencher-labeled MAB. The MAB exists at equilibrium between a nonstructured random coil and a compact intramolecular quadruplex. Addition of thrombin (gray ellipse) shifts the equilibriumin favor of the quadruplex structure, which draws the fluorophore (F) and quencher (Q) closer, leading to fluorescence quenching. The working mechanism of the donor–acceptor-labeled MAB is similar to the quench-type MAB. The arrows of the backbone of the oligonucleotidesindicate the 5–3polarity of DNA.

  17. Chaoyong James Yang et al, Chaoyong James Yang, Mauricio Pinto, Kirk Schanze,and Weihong Tan*.Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2572 –2576

  18. 前景与展望 近年来,分子信标技术得以飞速发展,已渗透到结 构和分子生物学、基因和生物技术等领域的各个方 面。毫无疑问的是分子信标技术有着广阔的应用空 间。 随着研究的深入,分子信标作为一种高特异性、 高敏感性的分子探针必将在基因结构、疾病诊断、 疾病机制、药物筛选等方面得到更广泛的应用。

  19. Thank you!

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