1 / 62

MỘT SỐ KỸ THUẬT MÔ - TẾ BÀO HỌC CƠ BẢN

MỘT SỐ KỸ THUẬT MÔ - TẾ BÀO HỌC CƠ BẢN. AFIP Laboratory Methods in Histotechnology. Introduction

atara
Download Presentation

MỘT SỐ KỸ THUẬT MÔ - TẾ BÀO HỌC CƠ BẢN

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. MỘT SỐ KỸ THUẬT MÔ - TẾ BÀO HỌC CƠ BẢN

  2. AFIP Laboratory Methods in Histotechnology Introduction High quality histopathology depends on high quality histotechnology. Microscope specimens that are substandard, i.e.,poorly fixed, cut, or stained, impede the pathologist in making an accurate diagnostic evaluation.

  3. 1. Lấy bệnh phẩm 1.1- Lấy trúng: Lấy bệnh phẩm trúng là lấy đúng vùng tổn thương. Trong trường hợp sinh thiết, nếu điều kiện cho phép nên lấy nhiều mảnh ở nhiều vị trí. Với các bệnh phẩm phẫu thuật cần lấy cả vùng lành và vùng bệnh trên cùng một mảnh bệnh phẩm. 1.2 - Lấy đủ: Chủ yếu là đủ thành phần, đủ lượng mô tối thiểu cần thiết cho việc chẩn đoán.

  4. 2. Cố định bệnh phẩm 2.1 - Mọi bệnh phẩm phải được cố định ngay sau khi lấy. 2.2 - Không được làm giập nát bệnh phẩm (Khi pha không dùng kẹp có mấu, lưỡi dao pha phải sắc, mỏng và dài, cắt một chiều và bệnh phẩm phải đặt trên một miếng gỗ hoặc plastic) 2.3 - Bệnh phẩm không được cắt quá dày: Thường cắt từ 3 - 5 m. Với những bệnh phẩm mềm (não, chất nạo ...) có thể cố định vài giờ sau đó pha lại. Trong trường hợp chuyển đúc bằng máy, bệnh phẩm không được cắt dày hơn chiều cao của lòng khuôn nhựa (cassette).

  5. 2. Cố định bệnh phẩm 2.4 - Không để một mặt bệnh phẩm dính vào thành lọ: Cần cho thuốc cố định vào lọ trước rồi mới cho bệnh phẩm vào và lắc mấy vòng. Nếu có điều kiện bệnh phẩm vừa cố định vừa được lắc càng tốt. 2.5 - Đủ dung dịch cố định cần thiết. 2.5.1 - Dung dịch cố định phải đúng nồng độ: Không được đặc hoặc loãng quá đều làm cho bệnh phẩm giòn hoặc chưa được cố định tốt. 2.5.2 - Thể tích dung dịch cố định phải gấp ít nhất 10 lần thể tích bệnh phẩm.

  6. 2. Cố định bệnh phẩm 2.6 - Thời gian cố định thích hợp: Tuỳ thuộc vào loại và độ dày của bệnh phẩm, vận tốc xuyên thấm, nồng độ dung dịch cố định. VD: Với các bệnh phẩm sinh thiết có thể cố định 3 giờ là được. 2.7 - Chú ý với những trường hợp cố định đặc biệt. Glycogen: Cố định bằng dung dịch Gendre. Mỡ: Cố định bằng dung dịch formol 10%, cắt lạnh và nhuộm Soudan. Chú ý: Không có loại dung dịch cố định đa năng. Vì vậy khi tiến hành nghiên cứu cần tìm hiểu cố định bằng dung dịch cố định nào.

  7. MỘT SỐ DUNG DỊCH CỐ ĐỊNH THÔNG DỤNG + Dung dịch formol có đệm trung tính 10% - Formaldehyde 37 - 40% 100 ml - Nước cất 2 lần 900 ml - Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) 4 gr - Sodium phosphate dibasic anhydrous (khan) Na2HPO4(khan) 6,5 gr + Dung dịch formol 10% - Formaldehyde 37 - 40% 10 ml - Nước cất 2 lần 90 ml + Dung dịch cố định Bouin - Dung dịch nước bão hoà acid picric 75 ml - Formaldehyde 37 - 40% 20 ml - Acid acetic lạnh, nguyên chất 5 ml + Dung dịch cố định Gendre - Cồn 95% bão hoà acid picric 80 ml - Formaldehyde 37 - 40% 15 ml - Acid acetic lạnh, nguyên chất 5 ml

  8. 3. Vùi và đúc bloc 3.1 - Quy trình chuyển tay 3.1.1 - Áp dụng cho các bệnh phẩm có chiều dày < 2 mm - Cồn 900 15’ - Cồn 950 15’ - Cồn 1000 I 15’ - Cồn 1000 II 15’ - Cồn 1000 III 15’ - Xylen I 15’ - Xylen II 30’ - Xylen III 30’ - Paraffin I 30’ - Paraffin II 1 h - Paraffin III 1 h Chú ý : Bệnh phẩm phải lắc liên tục và hoá chất phải mới.

  9. 3. Vùi và đúc bloc 3.1.2 - Áp dụng cho các bệnh phẩm dày 5 - 8 mm - Cồn 800 2 h - Cồn 900 6 h - Cồn 950 8 h - Cồn 1000 I 4 h - Cồn 1000 II 6 h - Cồn 1000 III 8 h - Xylen I 4 h - Xylen II 8 h - Xylen III 10 h - Paraffin I 4 h - Paraffin II 6 h - Paraffin III 10 h

  10. 3. Vùi và đúc bloc 3.2 - Quy trình chuyển máy 3.2.1 - Áp dụng cho các mảnh sinh thiết và các mảnh mô nhỏ. Thời gian cố định tối thiểu 3 giờ. - Rửa nhẹ trong nước chảy. - Cồn 800 10’ - Cồn 950 3 lần x 15’/lần - Cồn 1000 3 lần x 15’/lần - Cồn 1000/xylen tỷ lệ 1/1 15’ - Xylen 2 lần x 15’/lần - Paraffin 3 lần x 15’/lần (*) - Paraffin trong hút chân không từ 15 - 20’. Nếu không có hút chân không ở thì (*) tăng thêm mỗi lần 5’ - Đúc bloc.

  11. 3. Vùi và đúc bloc 3.2.2 - Áp dụng cho các mô thông thường - Cồn 800 1 h - Cồn 950 3 lần x 1 h/lần - Cồn 1000 3 lần x 1 h/lần - Xylen 3 lần x 1 h/lần - Paraffin 3 lần x 1 h/lần - Paraffin trong hút chân không 1 h - Đúc bloc.

  12. 3. Vùi và đúc bloc 3.2.3 - Đúc bloc Có 2 yêu cầu cơ bản + Bệnh phẩm định hướng mô học đúng. + Thao tác nhanh để bệnh phẩm, paraffin và cassette gắn kết vững chắc.

  13. 4. Kỹ thuật cắt và dán mảnh 4.1 - Dao cắt: Yêu cầu + Sắc + Không sước hoặc mẻ 4.2- Một số điều kiện để cắt tốt + Nhiệt độ phòng cắt 250C + Độ nghiêng lưỡi dao 450 4.3 - Dán mảnh cắt: Thường dùng albumin với độ pha loãng 2% và hơ nóng dưới 500C.

  14. 5. Nhuộm 5.1 - Phương pháp nhuộm hematoxylin-eosin chuẩn cho mảnh cắt Paraffin 5.1.1 - Nguyên tắc: Là phương pháp nhuộm phối hợp thông dụng nhất bằng cách nhuộm kế tiếp một phẩm nhuộm “bazơ” - hematein và một phẩm nhuộm bào tương “axit” - eosin. Việc nhuộm nhân được nhuộm “tăng dần” người ta dừng lại khi những cấu trúc của nhân rõ nét nhất. Ngược lại với việc nhuộm bào tương “giảm dần” bằng cách nhuộm sẫm lên rồi loại phẩm thừa bằng cồn có độ thấp.

  15. 5. Nhuộm 5.1.2 - Tiến hành: - Tiêu bản tẩy paraffin trong 3 lần xylen, mỗi lần 2’ - Loại xylen bằng cồn 1000, cồn 950 mỗi lần 2’ - Rửa nước chảy 5’ - Loại các sắc tố do thuốc cố định nếu bệnh phẩm được cố định trong các dung dịch cố định có thuỷ ngân (HgCl2) hoặc Crom (Cr2O3) v.v... Sau đó rửa nước chảy 5’ - Nhuộm nhân trong một dung dịch Alum hematoxylin tuỳ ý với thời gian thay đổi tuỳ từng loại thuốc nhuộm. - Rửa kỹ trong nước chảy cho tới khi mảnh cắt có màu xanh thường từ 5’ hoặc lâu hơn. - Biệt hoá trong cồn acid 1% (1ml HCl nguyên chất trong 100 ml cồn 700) - Rửa kỹ trong nước chảy cho tới khi mảnh cắt có màu xanh trở lại (10 - 15’) hoặc nhúng trong một dung dịch kiềm (nước ammoniac loãng) khoảng 5’ rồi rửa nước. - Nhuộm trong dung dịch Eosin Y 1% 10’ - Rửa nước chảy 1 - 5’ - Tẩy nước bằng cồn tuyệt đối, làm trong và gắn lamelle.

  16. 5. Nhuộm 5.1.3 - Kết quả - Nhân tế bào xanh/đen - Bào tương thay đổi từ hồng đến hồng sẫm - Các sợi cơ hồng sẫm đến đỏ - Hồng cầu vàng da cam hoặc đỏ - Các sợi fibrin hồng thẫm Giới thiệu một số dung dịch hematoxylin và thời gian nhuộm: Cole’s 20- 45’ Delafield’s 15 - 20’ Ehrlich’s Mayer’s (tăng dần) 20 - 45’ Mayer’s (tăng dần) 10 - 20’ Mayer’s (giảm dần) 5 - 10’ Harris’s (tăng dần khi nhuộm tế bào) 4 - 30’ Harris’s (giảm dần) 5 - 15’ Gill’s (giảm dần) 5 - 15’

  17. 5. Nhuộm 5.1.4 - Tiêu chuẩn của một tiêu bản cắt nhuộm HE đạt yêu cầu - Mảnh cắt mỏng đều, không gấp, sước hoặc rách - Kích thước của mảnh cắt to gần bằng thật - Hơ không giãn quá - Nhân tế bào có màu xanh đến xanh đen - Bào tương có màu từ hồng đến đỏ - Hồng cầu màu da cam hoặc đỏ đậm - Các sợi cơ hồng đến đỏ - Không bị ám nước - Không có bọt khí

  18. 5. Nhuộm 5.2 - PHẢN ỨNG ACID PERIODIC - SCHIFF (P.A.S) 5.2.1 - Nguyên tắc: Dùng một tác nhân oxi hoá là acid periodic để phá vỡ mối liên kết của 2 nguyên tử C trong một số nhóm hoá học (các nhóm glycol 1 - 2, hydro 1. amino - 2, hydroxy - 1, alkylamino - 2 và hydroxyl - 1, ceto - 2) làm xuất hiện các nhóm aldehyt. Các nhóm aldehyt này nhìn thấy được nhờ phản ứng của thuốc thử Schiff (fuschin basic không màu bởi axit sulfureux) tạo thành chất có màu đỏ.

  19. CH2OH CH2OH O O H H H H H H O O O O H H OH H O H O OH CH2OH O H H H F(SO2H)2 O O H H C C F 5. Nhuộm HIO4

  20. 5. Nhuộm 5.2.2 - Tiến hành: - Tiêu bản tẩy paraffin qua cồn và rửa nước như nhuộm HE. (*) - Oxi hoá trong dung dịch acid periodic 1% 10 phút - Rửa nước chảy 5 phút - Cho phản ứng với thuốc thử Schiff từ 5 - 30 phút - Rửa nước chảy 5 phút -Nhuộm nhân trong hematoxylin từ 30 giây đến vài phút - Rửa nước chảy 3 phút - Nhúng nhanh qua cồn acid vài giây - Rửa nước chảy 10 phút - Chuyển qua cồn 950. Khử nước bằng cồn tuyệt đối. Làm trong bằng xylen. Gắn baume Canada.

  21. 5. Nhuộm 5.2.3 - Kết quả: Glycogen màu đỏ Nhân tế bào màu xanh - xanh đen Nấm, chất nhầy màu hồng - đỏ Chú ý:Nếu muốn nhuộm Glycogen cần có một tiêu bản làm chứng. Sau (*) tiêu bản làm chứng được xử lý 1 giờ trong Diastase 1% ở 370 rồi rửa nước và oxi hoá bằng HIO4 như tiêu bản kia. Nếu cả 2 tiêu bản đều dương tính với thuốc thử Schiff thì không phải là Glycogen. Ngược lại, tiêu bản làm chứng âm tính, tiêu bản kia dương tính thì chất cần tìm là glycogen. Nếu không có Diastase có thể dùng nước bọt thay thế, kết quả cũng tốt. Pha thuốc thử Schiff: Hoà tan Fuschin basic (hoặc Pararosanilin) 1 g trong 200 ml nước cất đun sôi. Lắc mạnh cho tan hết. Để nguội đến 500C đem lọc. Thêm vào đó 2 ml axit HCl nguyên chất. Tiếp tục để nguội đến 250C cho thêm metabisulfit sodium 1 g (hoặc potassium Na2S2O5 hoặc K2S2O5). Để dung dịch 24 giờ trong bóng tối. Dung dịch chuyển màu vàng rơm là tốt.

  22. 5. Nhuộm 5.3 - NHUỘM SỢI LIÊN VÕNG (RETICULIN) Việc pha chế các dung dịch tẩm bạc thường xảy ra các phản ứng sau: AgNO3 + KOH  AgOH + KNO3 2 AgOH = Ag2O + H2O Ag2O = 2 Ag+ + O 2 NH3 + Ag+ [Ag(NH3)2]+

  23. 5. Nhuộm 5.3.1 - Nguyên tắc: Các phương pháp tẩm bạc là những phương pháp thông dụng để nhuộm sợi liên võng. Chúng dựa trên lối sử dụng một muối bạc không bền vững (thường là nitrat bạc ammonical) và một chất khử (thông dụng nhất là formol): phản ứng khử muối bạc thành bạc kim loại màu đen sẽ lắng đọng chọn lọc trên các sợi liên võng. Những lưu ý cần thiết: Kết quả của phương pháp tẩm bạc chỉ đạt được kết quả tốt nếu thực hiện một số yêu cầu sau. - Chỉ sử dụng các muối bạc tinh khiết. - Dung nước cất 2 lần, không dùng nước cất 1 lần - Dụng cụ thuỷ tinh phải rất sạch. - Tránh bụi rơi vào dung dịch - Không bao giờ để dụng cụ kim loại tiếp xúc với dung dịch

  24. 5. Nhuộm 5.3.2 - PHƯƠNG PHÁP GOMORI 5.3.2.1 - Các bước tiến hành: - Cố định: formol 10% - Tiêu bản tẩy paraffin , qua cồn và rửa nước như nhuộm HE - Oxi hoá trong dung dịch nước 0,5 permanganat potassium 1 phút - Rửa nước chảy 2 phút - Biệt hoá trong dung dịch 2% metabisulfit potassium 1 phút - Rửa nước chảy 2 phút - Làm nhạy trong dung dịch 2% sulfat Fe và ammonium 1 phút - Rửa nước chảy 2 phút rồi qua 2 bể nước cất 2 lần, mỗi lần 30 giây - Tẩm trong dung dịch nitrat bạc amoniacal 1 phút - Rửa nước cất 20 giây - Khử trong dung dịch 20% formaldehyde 3 phút - Rửa nước 3 phút - Thúc trong dung dịch 0,2% chlorua vàng 10 phút - Rửa nước cất - Chuyển qua dung dịch 2% metasulfit potassium 1 phút - Cố định trong dung dịch 2% hyposulfit sodium 1 phút - Rửa nước 1 phút - Có thể nhuộm nhân bằng dung dịch kernechtrot 5 phút - Rửa qua nước - Cồn 950, cồn 1000 - Xylen - Gắn nhựa

  25. 5. Nhuộm 5.3.2.2 - Kết quả: Các sợi liên võng màu đen sẫm Nhân tế bào màu đỏ Pha dung dịch nitrat bạc ammoniacal: Lấy 10 ml dung dịch nitrat bạc 10%, thêm vào đó 2 - 2,5 ml KOH 10%, nhỏ từng giọt amoniac đậm đặc cho đến khi kết tủa hình thành lại tái hoà tan. Lại thêm từng giọt dung dịch nitrat bạc cho tới khi kết tủa còn vẩn nhẹ. Pha loãng gấp đôi dung dịch với nước cất. Đựng trong lọ màu tối.

  26. 5. Nhuộm 5.4 - Nhuộm Papanicolaou 5.4.1 - Nguyên tắc: Kết hợp một phẩm nhuộm nhân bằng hematoxylin Harris và một phẩm nhuộm bào tương bởi Orange G và một phẩm nhuộm chủ yếu là Verte lumière, nâu Bismarck và Eosin (hỗn hợp đa sắc EA50 của Papanicolaou). Từ khá lâu, phương pháp này được chọn để nhuộm các tế bào ung thư.

  27. 5. Nhuộm 5.4.2 - Các bước tiến hành: - Tiêu bản nhúng liên tục trong cồn 900, 800, 500 rồi nước cất 2 lần x 30’ mỗi bể. - Nhuộm nhân trong hematoxylin Harris 3 - 6 phút. - Rửa nước cất - Nhúng 6 lần trong dung dịch acid HCL 0.25%. - Rửa nước chảy 6 phút (rồi tráng nước cất 30” ). - Chuyển liên tục trong cồn 500, 700, 800, 900 30” mỗi bể. - Nhuộm trong dung dịch Orange G 90”. - Nhúng trong 2 bể liên tiếp cồn 950 30” mỗi bể. - Nhuộm trong dung dịch đa sắc EA50 của Papanicolaou 90’’. - Nhúng qua 3 bể cồn 950 30” mỗi bể. - Chuyển vào cồn tuyệt đối. - Chuyển vào hỗn hợp cồn/xylen tỷ lệ 1:1 rồi vào xylen và gắn Baume.

  28. 5. Nhuộm 5.4.3 - Kết quả : - Nhân tế bào xanh xám hoặc tím. - Bào tương của các tế bào ưa acid màu hồng đỏ hoặc vàng. - Bào tương của các tế bào ưa bazơ xanh sáng đôi khi xanh ve sẫm

More Related