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实验八

实验八. SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）. 一 . 实验目的. 1. 学习 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理 2. 掌握垂直板电泳的操作方法 3. 熟悉蛋白印迹技术原理和方法. 二 . 实验原理. SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 : 是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS （十二烷基磺酸钠） 1967 年， Shapiro 等人首先发现，如果在 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( 聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷 ) 系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（ SDS ），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？.

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Presentation Transcript

  1. 实验八 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

  2. 一. 实验目的 1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 • 2.掌握垂直板电泳的操作方法 • 3.熟悉蛋白印迹技术原理和方法

  3. 二. 实验原理 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠） • 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？

  4. SDS的作用 • SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 • 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小

  5. 当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b  m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量

  6. SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳

  7. Gel 15% 5% 10% 200 200 97 200 66 97 66 97 66 45 45 29 29 45 29

  8. 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量

  9. 实验操作大致流程图 SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影

  10. 操作过程 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的小烧杯2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封条和隔离板)*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板

  11. 分离胶(10% 10ml) 浓缩胶(5% 10ml) ddH2O 4.05ml 6.8ml 30%Acr 3.3ml 1.7ml Buffer 1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml 10%SDS 100µl 100µl 10%Ap 50µl 100µl TEMED 10µl 10µl 配 胶

  12. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶凝 * 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡

  13. * 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡 * 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝 * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平 5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液 *用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出

  14. 6.上样： （1）marker 5µl （2）细胞样品10 µl + 2×上样buffer 10µl 共20µl 100℃沸水浴，3-5min ？（蛋白变性） 7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 15µl *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔

  15. 8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA（180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色1小时左右10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 11.实验结果分析

  16. 蛋 白 样 品 距 加 样 端 迁 移 距 离 c m 相 对 迁 移 率 = 溴 酚 蓝 区 带 中 心 距 加 样 端 距 离 c m 五.分析计算 按下式计算相对迁移率： 每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性

  17. 注意的问题 蛋白质电泳 常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套

  18. ？ • 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? • 电极缓冲液中甘氨酸的作用? • 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? • 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?

  19. 浓缩胶的作用 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层

  20. 常见问题及解决办法 1.纹理和拖尾现象：由于样品溶解不好引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素 2.蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量 3.电泳时间比正常要长。可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高

  21. 4.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致 • 5.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片得凝胶聚和不完全 • 6.凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂

  22. 试剂配制 (1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。 4℃，1-2月（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏水定容至100ml（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定容至100ml

  23. （7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：（7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。（10）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml

  24. 影响因素 1.溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 2.样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10～100mmol/L 3.二硫键是否完全被还原

  25. 转膜 • 1 带手套切2张（L：8.4cm，W：7.6cm）尼龙膜和12张（L：8.2cm，W：7.4cm）的滤纸，并用去离子水浸泡（浸泡时要让水从下往上慢慢湿透）过午。并用铅笔在膜上做+/-标记。 • 2在转膜前10min，把膜取出浸入转移缓冲液中。 • 3在一托盘中注入500ml左右的转移缓冲液，放入4块海绵和12张滤纸及转膜所用模具。 • 4在模具的黑色板上先铺一块海绵，接着依次放3张浸湿的滤纸，对齐后，用玻璃棒赶净气泡（很关键）。 • 5在滤纸上放凝胶，放的时候可加一点缓冲液在凝胶上。

  26. 2放好胶后，放尼龙膜。注：尼龙膜一旦放到胶上就不可再作移动，因为这时已有蛋白结合到膜上。然后，在膜上加一点缓冲液，用玻璃棒尽量使之铺平 3在膜上依次放好三张滤纸和海绵后，即可夹好转膜模具。注：每层间都要注意赶气泡 4黑对黑，白对红在电泳槽中放好模具。并加一块冰在电泳槽中，以防转膜过程中温度过高，影响转膜效率。 5在用转移缓冲液注满电泳槽后。红对红，黑对黑接好转膜装置（及电泳装置）。设置电泳参数：60v ，2.5hours

  27. 丽春红染色 1. 转膜结束后，取下转膜装置，打开夹板，小心用镊子取出尼龙膜，蛋白面朝上置于10ml 1×的丽春红染液中，摇床上染色10min左右 2. 蛋白面朝上，用去离子水洗3-4次，至红色基本褪去后，拍照。 3. 再用去离子水洗膜至红色完全褪去

  28. 封闭 • 取出两块膜，用滤纸将残留液体吸净后，将两块膜的蛋白面相对放入封闭液 2.RT，1-2hours 或 4℃过夜

  29. 一抗 1 把膜从冰箱中取出，RT ，30min。 注： 封闭液可回收 • 四个角蘸点水铺好保鲜膜后，加1：100的一抗500ul（抗体稀释液495ul+5ul mouse p65抗体）于保鲜膜上 • 蛋白面朝下，使尼龙膜和一抗充分接触。注避免产生气泡，如有气泡，可用镊子将膜的四角轻轻提起，排出气泡 • 盖上玻璃平皿，RT下孵育2hours • TBST 10min×2 ； TBS 10min×1

  30. 二 抗 1.同上铺好保鲜膜，加1：1000 的二抗1000ul（1ul mouse 抗人IgG-HRP+ 999ul抗体稀释液） 2.同上蛋白面朝下放好尼龙膜，要避免产生气泡 3.盖上平皿，同上RT孵育2 hours 4.TBST 10min ×2 ； TBS 10min×1

  31. 显 色 • 1 铺好保鲜膜，分别滴加5滴发光试剂A和B，混合1min • 2同上蛋白面朝下放好尼龙膜，要避免产生气泡。反应1min • 3用镊子夹起尼龙膜，用滤纸将多余的发光试剂吸尽，至没有液体滴下为止 • 4 将尼龙膜蛋白面朝上置于另外两块铺好的保鲜膜上。用滤纸将膜边的残余液体吸净后，折回保鲜膜，将之放到压膜用的夹板里

  32. 转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转移 滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致 以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜5min 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡 电转时间：200mA 1-2h,转移结束后，膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置

  33. （3）封闭 5％脱脂奶粉或3％BSA （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制） 时间：室温3h或4ºC 过夜 封闭液回收

  34. 显色 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 化学发光显影 最常用,辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定

  35. 膜的再利用 1.化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer洗涤后（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的 －2ME ）用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次 2.碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交

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