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第 2 單元. 生物技術實際應用之實例 - 戴奧辛生物檢測系統之建立. 台灣大學生命科學系暨動物學研究所 副教授 李心予. 【 本著作除另有註明外，採取 創用 CC 「姓名標示 - 非商業性 - 相同方式分享」台灣 2.5 版 授權釋出 】. 課程目的. 本次課程之目的： 強調如何由科學觀察過程經由轉換後，成為一種能夠增進人類福祉的過程。. 實驗室環境. 充斥危險儀器 佈滿致命化學藥品 不斷重複的無聊程序. Magnus Manske. 如何找到研究科學的樂趣.
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第 2 單元 生物技術實際應用之實例-戴奧辛生物檢測系統之建立 台灣大學生命科學系暨動物學研究所 副教授 李心予 【本著作除另有註明外，採取創用CC「姓名標示-非商業性-相同方式分享」台灣2.5版授權釋出】
課程目的 • 本次課程之目的： 強調如何由科學觀察過程經由轉換後，成為一種能夠增進人類福祉的過程。
實驗室環境 • 充斥危險儀器 • 佈滿致命化學藥品 • 不斷重複的無聊程序 Magnus Manske
如何找到研究科學的樂趣 • What Dr. Larry Ewing told me 14 years ago: You are the first one to know this!!!!
戴奧辛(dioxin) • 210種不同的化合物 • 75 Polychlorinated dibenzo-P-dioxins • 135 Polychlorinated dibenzofurans • 高熔點、高沸點、脂溶性 • 不異分解
毒性計量 • 重量表示方法： • pg/g • ppt or ppb • pg/kg-bw • 當量表示方法： • ng-TEQ/Nm3(空氣) • pg-TEQ/g(土壤) TEQ (Toxicity Equivalency Quantity of 2,3,7,8 TCDD) = TEF (Toxicity Equivalency Factor ) × true concentration 臺灣大學 李心予 資料來源:行政院美國環保署「廢棄物焚化爐戴奧辛管制及排放標準」86年8月6日
生成來源 • 焚化廠及發電廠 • 交通工具 • 工業原料 • 其他人為燃燒 • 自然生成：濃度約在10-12ppt Magnus Manske Original uploader was Alanmak at en.wikipedia
世紀之毒 • 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD) • 暴露途徑：呼吸、水源、食物 • 環境賀爾蒙 • 氯痤瘡，損害肝臟與免疫系統、影響酵素的運作功能、消化不良及肌肉、關節痛、流產、畸型兒、男性荷爾蒙減少現象、色素沈著、多毛症、增加皮膚脆弱性、出疹、出水泡、視力受損及膽硬脂血症。 • 國際癌症研究中心：人類致癌物(1997) Muumi 氯痤瘡
化學檢驗方法 • 樣品採集->提取->酸性矽膠管柱淨化->酸性氧化鋁淨化->活性碳管柱淨化->二次淨化 • 氣相色譜電子捕捉系統 (gas chromatography electron capture detection) • 質譜儀 (mass spectrometry) Hey Paul
戴奧辛生物檢驗方法 • 活體內生物指標物 (in vivo biomarkers) • cytochrome P450 1A (CYP1A) • 活體內生物檢測 (in vivo bioassays) : • 活體內生物檢測 • EROD (ethoxyresorufin -O- deethylase) assay • CALUX (chemical-activated luciferase expression) assay
抗體 • 酵素免疫吸收分析 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) • 生物感應器（biosensor）
芳香族碳氫化合物受器 (AHR)反應途徑 AHR ARNT TCDD 對應增強子 (responsive enhancer) • 細胞質(Cytoplasm) nucleus(細胞核) 臺灣大學 李心予 • 戴奧辛影響細胞生理反應的機轉很多，其中研究最廣泛的是芳香族碳氫化合物受器訊息傳遞路徑
CALUX 生物檢測 反應子 戴奧辛 冷光酶 (Luciferase) pGL3-basic or pGL2-啟動子 細胞 • 常用的生物檢測方法，主要的構思就是在dioxin response elements後面接上reporter gene 臺灣大學 李心予
標準曲線 螢光量 螢光量 已知濃度戴奧辛 未知濃度戴奧辛 • 由冷光的定量做出一組標準曲線圖，做為偵測環境污染物的工具，以建立一套比現有生物檢測方法具有更高敏感性的系統 臺灣大學 李心予
AF210905 Mus musculus CYP1A1 (Cyp1a1) 基因，啟動子區域及其部分序列 1 32 209 661 1593 CTP1A1 MP M4P2 質體建構 臺灣大學 李心予 • 構築戴奧辛檢測用的DNA質體
細胞株 • RAW264.7 • 小鼠巨噬細胞 (Mouse macrophage) • Hepa1C1C7 • 小鼠肝癌細胞 (Mouse hepatoma ) • H4IIEC3 • 大鼠肝癌細胞 (Rat hepatoma )
討論 • 戴奧辛含量的規定 • 聯邦飲用水標準：0.00003 mg/l • 美國乳製品的含量標準:1 ppt • 日本住宅區土壤戴奧辛類管制標準：1000 pg TEQ/g • 台灣焚化爐排放廢氣容許量：0.1~0.5ng-TEQ/Nm3 • Functional toxicology • 環境檢體測試
螢光共震能量傳導 (Florescence Resonance Energy Transfer, FRET) AHR+HSP90 HSP90 AHR TCDD 細胞質(Cytoplasm) 細胞核( nucleus) • 經由文獻中了解戴奧辛進入細胞後的作用機制，進而研發另一種戴奧辛之分子偵測方式 (FRET)。
AHR AHR HSP90 HSP90 HSP90 HSP90 戴奧辛 細胞質 細胞核 機制 細胞質 細胞核 臺灣大學 李心予 • 當環境中有戴奧辛時，誘導AHR從HSP90的結合態解離，進而轉進細胞核內，與AHR的核內結合對象ARNT (AHR nucleur translocator) 雙體化結合
螢光共振能量轉移的原理 臺灣大學 李心予 • 在兩分子距離極為接近的情況下，供體由激發態躍遷所釋放出的能量將轉而激發受體
戴奧辛生物檢測的優勢與目標 • 操作容易、成本低廉、效率性高 • 快速的初步評估 • 直接的戴奧辛生物危害的評估 • 取代傳統檢測技術仰賴質譜儀的限制 • 落實於環保署農委會等單位,大幅簡化對戴奧辛之定量與定性手續
The End Thanks for your attendance 謝謝各位的參與
參考書目 • Huang YW, Lee WS, Chang-Chien GP, Lin CI, Kao CY, Lee H*. Establishment of cellular detection systems for dioxin-like compounds. Chinese Bioscience, 47 (1) : 1-18, 2004 • CI Lin, CH Hsieh, JT Wu, WS Lee, GP Chang-Chien, CY Pan and HLee*. Establish of a FRET detection system for dioxin-like compounds. Chinese Bioscience, 50(1):12-25. 2007. • CI Lin, CH Hsieh, SSY Lee, WS Lee, GP Chang-Chien, CY Pan and HLee*. Establish of a FRET based bioassay for dioxin-like compounds. J of Biomed. Sci. 15(6): 833-840. 2008. [Epublished ahead of print, July 5]. (36/81, 2.024, 2007)
