Reação de Polimerização em Cadeia - PCR

1. Reação de Polimerização em Cadeia - PCR 1-Introdução 2-Automatização da PCR 3-Sistema de reação 4-Iniciadores – primers

2. 1-Introdução Kary Mullis 1985 – Cetus Corporation A PCR é um sistema para a replicação do DNA in vitro, que permite que uma seqüência “alvo”de DNA seja amplificada em milhares de cópias em apenas algumas horas

3. 2-Automatização da PCR • O isolamento da DNA polymerase termoestável da bactéria Thermus aquaticus, a Taq polymerase. • Ciclos com oscilações entre altas e baixas temperaturas, controladas por computador

4. 2-Automatização da PCR Termociclador

5. Etapas básicas da PCR: 2-Automatização da PCR • 1- desnaturação térmica do DNA molde • 2- Anelamento de oligonucleotídeos sintéticos – iniciadores • 3- Polimerização das novas fitas a partir dos iniciadores

6. 3-Sistema de reação Em um microtubo... • DNA a ser amplificado (pequenas quantidades) • Solução tamponada contendo: • DNA polimerase • Iniciadores • dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) • Cofator enzimático MgCl2 • Água milliQ

7. 4-Iniciadores - primers • Tamanho – entre 10 a 30 bases • Composição de bases - ~50% de G/C • Seqüências – não devem ter complementaridades intra ou inter molecular • Cálculo da Tm

8. 4-Iniciadores - primers Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos iniciadores • Do inglês: melting temperature • Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio entre a formação e a dissociação dos híbridos gerados pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio • Para o cálculo: • Tm= 2(A+T) + 4(G+C)