实验十九　血清碱性磷酸酶的磷酸苯二钠法测定

实验十九　血清碱性磷酸酶的磷酸苯二钠法测定实验十九　血清碱性磷酸酶的磷酸苯二钠法测定

碱性磷酸酶是一组在碱性环境中水解磷酸酯的酶类，分子量随不同组织来源不同，广泛分布在人体的骨、肾、肠、血清、胆汁等部位，但以骨骼，牙齿、肾和肝中含量较多，正常人血清中的ALP主要来源于肝，少部分来自骨骼。血清ALP测定可用于肝胆系统及骨骼系统疾病的辅助诊断。是临床常做的酶类检验项目之一。测定ALP的方法主要分为二种，一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力，如β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根及磷酸化的缺点；二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这种方法又可分为：1，酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定。2，生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如磷酸对硝基酚法。碱性磷酸酶是一组在碱性环境中水解磷酸酯的酶类，分子量随不同组织来源不同，广泛分布在人体的骨、肾、肠、血清、胆汁等部位，但以骨骼，牙齿、肾和肝中含量较多，正常人血清中的ALP主要来源于肝，少部分来自骨骼。血清ALP测定可用于肝胆系统及骨骼系统疾病的辅助诊断。是临床常做的酶类检验项目之一。测定ALP的方法主要分为二种，一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力，如β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根及磷酸化的缺点；二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这种方法又可分为：1，酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定。2，生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如磷酸对硝基酚法。

【目的要求】 • 1、掌握磷酸苯二钠法测血清ALP活性。 • 2、熟悉ALP测定的其它方法 • 【实验原理】 • 磷酸苯二钠法的原理： • 碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解释放出酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，根据红色的深浅确定ALP活性。 • 单位定义：100ml血清在37度与底物作用15分钟，产生1mg酚为1个金氏单位。

操作步骤： • 1，校正曲线的制作　按表操作 • 加入物(ml) B 1 2 3 4 5 • 酚标准液 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 • 蒸馏水 1.1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 • 碳酸盐缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 • 铁氰化钾溶液 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 • 相当于金氏单位0 10 20 30 40 50 • 立即混匀，于510nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用蒸馏水调零，读取各管吸光度。以吸光度值为纵坐标，相应的酶活性单位为横坐标绘制校正曲线。

2，标本的测定　按表操作 • 加入物(ml) 对照管测定管 • 血清 - 0.1 • 碳酸盐缓冲液 1.0 1.0 • 37度水浴5分钟 • 底物溶液(预温至37度)1.0 1.0 • 混匀,37度水浴15分钟 • 铁氰化钾溶液 3.0 3.0 • 血清 0.1 - • 立即混匀，于510nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用蒸馏水调零，读取各管吸光度。以测定管与对照管吸光度之差值查校正曲线，得酶活性。【参考值】成人；3-13金氏单位；儿童：5-28金氏单位

【注意事项】 • 1，底物溶液中不应含有游离的酚，如有酚则空白管显红色，说明磷酸苯二钠已经开始分解，应弃去不用。 • 2，铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定显色的作用。该液应避光保存，如出现蓝绿色即应废弃。 • 加入铁氰化钾溶液后必须应即混匀，否则显色不完。 • 4，黄疸血清及溶血血清应分别作对照管，一般血清标本可以共用对照管。 • 【方法评价】 • 磷酸苯二钠法与更早应用的甘油磷酸钠法相比具有较大的进步，如水解速度快，故保温时间较短；灵敏度较高；显色稳定；不需去蛋白，操作简便，快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低。酶单位不是国际单位，受胆红素和溶血的干扰。

【临床意义】 • 1，升高：肝胆疾病。主要见于（1）阻塞性黄疸，急、慢性黄疸性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升高，其中以癌性梗阻最明显。（2）各种骨骼疾病如佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等，由于骨损伤或病变使骨细胞内高浓度的ALP释放入血，引起血清ALP升高。 • 2，降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症，维生素C缺乏症。 • 【思考题】 • 1，血清ALP测定有何临床意义。 • 2，对于ALP水解的底物测定有哪些方法

实验十九 血清碱性磷酸酶的磷酸苯二钠法测定