6. Miško medžių mikrodauginimas

1. 6. Miško medžių mikrodauginimas 6.1 Mikrodauginimo metodai (dr. D. Danusevičius, dr. V. Baliuckas). 6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų ūkyje (dr. A. Pliūra).

2. 6.1 Mikrodauginimo metodai Mikrodauginimas tai vegetatyvinis dauginimas in vitro (dirbtinėje aplinkoje): organogenezė, somatinė gemalų genezė, somatinė hibridizacija ir augūnų šaknydinimas (FAO 2004). Definicijos Morfogenezė- tai ląstelių diferenciaciją į skirtingus audinius ir struktūras. Oganogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų morfogenzėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo terpėje) ląstelių. Kai ląstelių diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrėžtas organas (šaknis, ūglis), šis procesas vadinamas organogenezė; kai diferenciacijos galutinis rezultatas nėra organas – morfogenezė (pvz. organo užuomazga ar organų kompleksas). Audinių kultūra- tai augalo išauginimas iš audinių laboratorijoje. In vitro dauginimas- auginimas dirbtinėje aplinkoje (laboratorijoje). Meristema- aktyviai besidauginančios ląstelės produkuojančios naujus audinius. Eksplantas- augalo audiniai ar dalys iš kurių auginamas naujas augalas in vitro sąlygose Sitkinės eglės gemalo formavimasis iš neapvaisintos kiaušidės audinių Pagrindinis vegetatyvinio ir mikrodauginimo privalumas –greitas identiškų tam tikro individo kopijų gavimas. Lytinio dauginimo atveju reikia laukti lytinės brandos (pvz. apie 10-20 m. p. eglei), be to 1/2 genų gaunama iš tėvinio genotipo, kas gali būti nepageidaujama.

3. Masinio vegetatyvinio miško medžių dauginimo metodai Pagrindinai metodai: 1. Organogenezė- augalų išauginimas iš meristemų (pvz. kaliuso) laboratorinėse sąlygose (labiau tinkantis lapuočiams). 2. Somatinė gemalų genezė- gemalų išauginimas iš kaliuso ir dirbtinų sėklų sukūrimas laboratorinėse sąlygose bei įprastinis medelių auginimas iš sėklų (tinkantis spygliuočiams, dėl sunkumų su organogeneze). 3. Somatinė hibridizacija: nelytinis skirtingų genotipų somatinių ląstelių protoplastų (ląstelė be sienelės) suliejimo metodas. 4. Augūnų šaknydinimas ar skiepijimas: jaunų medelių ūglių karpymas, ūglių šaknydinimas ir augūnų auginimas medelyne (pigiausias metodas). P. eglės donoriniai medeliai augūnų šaknydinimui

4. Mikrodauginimo metodų derinio schematinis pavaizdavimas Galimi 3 pagrindiniai organogenezės metodai: a) tiesioginė mikroūglių indukcija iš eksplanto audinių ir jų šaknydinimas, b) adventyvinių (spontaninių) pumpurų indukcija, pumpurų sprogimas ir ūglių išauginimas c) ūglių indukcija iš kaliuso ir tolesnis šaknydinimas a) b) c) adventitious - plant parts, such as shoots and roots, produced in an unusual position on a plant or at an unusual time of development.

5. 1. Organogenzė Organogenzė- organų formavimosi ir vystymosi procesas: augalų morfogenezėje tai ūglių ir šaknų diferenciacija iš kaliuso, meristemos ar suspensinių audinių (audiniai skystoje maitinimo terpėje) ląstelių. Audiniai iš įvairių augalo dalių (pvz. drebulės žirginių), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį audinio tipą joms vystytis. Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės funkcijos neatliekančių ląstelių masė, vadinama kaliusu (trukmė apie 1 mėn.). 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)

6. Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui reikalingą genetinę informaciją, Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į tam tikros funkcijos ląsteles sąlygojančius augimo hormonus (organogenzė) ir paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu, įjungiami reikalingi genai ir išauginamas naujas augalas, mikroūglių ar pumpurų indukcijos ir šaknydinimo būdu. Augalo dalys, iš kurių gali būti paimti audiniai mikrodauginimui Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.

7. Organogenezės etapai Donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz. pumpurų, nesumedėjusių ūglių audiniai), sterilizacija ir audinių kultūros iniciacija, Adventyvinų (spontaniškų) pumpurų indukcija ir iš pumpurų išaugusių ūglių suformavimas, arba tiesioginis mikroūglių proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu augimą skatinančioje terpėje), Mikroūglių įšaknijimas (pagrinde veikiant hormonu auksinu augimą skatinančioje terpėje sunkus etapas dėl užkrato rizikos), Augalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje. adventitious - plant parts, such as shoots and roots, produced in an unusual position on a plant or at an unusual time of development.

8. Maitinimo terpės ir hormonai Maitinimo terpės tai kiekvienai rūšiai specifinės augimą skatinančios terpės (metabolizmą ir šviesos energijos įsisavinimą skatinantys enzimai, maisto medžiagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies šaltinis: pvz. gliukozė) Hormonai tai audinių diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime naudojamos tokios pagrindinės grupės: Auksiniai pagrinde indikuoja pridėtinių šaknų formavimąsi ir viršūninių pumpurų vystymąsi. Citokininai indikuoja ląstelių diferenciaciją į ūglius. Giberelinai skatina sėklų dygimą. Abscizinė rūgštis yra augimo inhibitorius ir naudojama embrionų susidarymo iš kaliuse stimuliacijai. Etilenas slopina audinių augimą ir skatina jų senėjimą. Adeninas naudojamas mikroūglių regeneracijai paspartinti.

9. 2. Somatinė gemalų genezė Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikro-dauginimo metodas kai gemalai išauginami iš vegetatyvinių ar negametinių audinių. Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame azote neribotam laikui. Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip paverčiami į dirbtines sėklas. Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius medelynuose (pigu). P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų institutas, Švedija ) Somatiniai sitkinės eglės gemalai ir dirbrinės sėklos gamybos principas: gemalas apvelgams kietų maismedžiagių lukštu, kurios sudrėkus pradeda irti ir tampra preinams maisto rezervas gemalui. Somatinė= nelytinė (augalai turi lytinės ir somatinės (augimo) ląstelės). Somatinė gemalų genezė = gemalų “gamyba” iš nelytinių ląstelių. Gemalų genezės sinonimas embriogenezė (ang. embryogenesis)

10. Pagrindinis somatinės gemalų genezės privalumas, kad juvenyliniai donorinio genotipo audiniai gali būti laikomi giliai užšaldyti neribotą laiko tarpą ir bet kada gali būti paimti somatiniam gemalų klonavimui. Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso nuo rūšies): Dirbtinės sėklos (paprastoji pušis, nes augūnai sunkiai įsišaknija) Kloninė miškininkystė (hedges) (p. eglė, nes augūnai lengvai įsišaknija) SGG naudojama Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P. radiata, Picea glauca x engelmanni “iš gemalinio audinio gabaliuko galima įveisti apie 6 ha miško” (Timmis 1998). Užšaldymas skystame azote (t žemiau –100C)

11. Vienų metų amžiaus p. pušies medeliai išauginti somatinės gemalų genezės būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų institutas). Dviejų metų amžiaus p. pušies medeliai išauginti somatinės gemalų genezės būdu: medeliai nesiskiria nuo įprastinių iš sėklų išaugintų medelių (Švedijos miškų institutas).

12. Somatinės gemalų genezės vystymo strategija Džordžijos technologijos institute, JAV Iš somatinių gemalų išauginti Picea glauca medeliai Kanadoje

13. Pagrindiniai somatinės gemalų genezės pasiekimai miškų ūkyje

14. Somatinė hibridizacija Somatinės hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima sukryžminti negiminingas rūšis, suliejant jų genomus. Gauto hibrido chromosomų skaičius yra lygus abiejų tėvinių augalų chromosomų sumai. Pagrindiniai somatinių hibridų kūrimo etapai: • gauti protolastus (ląstelės gali būti gaunamos iš įvairių augalų lapų); • sulieti gautus protoplastus, panaudojant elektros lauką arba cheminiu būdu; • iš gautų ląstelių išauginti naują augalą. Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell wall removed (www.ncbiotech.org/biotech101/glossary.cfm)

15. Somatinė hibridizacija Daugumoje atvejų somatiniai hibridai gali būti vėl kryžminami su tėvine rūšimi tam, kad naujieji genai būtų inkorporuoti į kultivuojamų augalų selekcines linijas.

16. Somatinė hibridizacija Bulvės protoplastai – matomi žali chloroplasto grūdeliai Du bulvės protoplastai prieš pat susiliejimą Iš kalio besiformuojantis naujas augalas www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/

17. Somatinė hibridizacija RFLP DNR genospaudžiai gali būti panaudoti, norint įsitikinti, ar tikrai buvo gauti somatiniai hibridai. www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/

18. Somatinė hibridizacija www.biotech.wisc.edu/SEEbiotech/

19. Augūnų šaknydinimas Donoriniai augalai (ang. hedges) auginami medelyne iki 3 m. amžiaus, t.y. pakankamas augalo pajėgumas produkuoti ūglius karpymui Donorinių augalų ūgliai karpomi ir šaknydinami, taip gaunant jų kopijas, kurias galima veisti miške Intensyvumas dindinamas priklausomai nuo mažiaus Didėjant amžiui, ūglių šaknijimosi potencija mažėja. Pvz. p. eglės optimalus amžius 3-10 m. Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti vegetatyviniam dauginimui šaknydinant augūnus. Švedijos miškų institutas 1998.

20. P. eglės augūnai iš jaunesnių medelių (augimas panašus kaip sėjinukų) Paprastosios eglės augūnai iš vyresnių medžių (augimas kaip šakų- linkimas į šoną).

21. Tipiški dviejų metų amžiaus p. eglės augūnai: nėra esminių skirtumų nuo sėjinukai (augūnų stiebeliai šiek tiek storesni ir šoniniai ūgliai ilgesni).

22. Literatūros sąrašas Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology). Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713. FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification. Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy. Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences, V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350. Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In: Molecular genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth Press Inc., p. 167-191. Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics and breeding of forest trees, p. 263-291. Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN: 082470794X. Publisher: CRC. Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science and Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716. Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius, ISBN 9986-433-36-3. Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering of floral sterility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody plants, Vol. 1, pp. 135–153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.