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IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES W. MAHJOUBI Laboratoire de Microbiologie H ôpital A. Mami de l’Ariana 31-Mars-2006

IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES W. MAHJOUBI Laboratoire de Microbiologie H ôpital A. Mami de l’Ariana 31-Mars-2006. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEXE. Mycobacterium tuberculosis: réservoir homme Mycobacterium bovis: réservoir bovin Mycobacterium africanum: Afrique noir.

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IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES W. MAHJOUBI Laboratoire de Microbiologie H ôpital A. Mami de l’Ariana 31-Mars-2006

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Presentation Transcript

  1. IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIESW. MAHJOUBILaboratoire de MicrobiologieHôpital A. Mami de l’Ariana31-Mars-2006

  2. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSISCOMPLEXE • Mycobacterium tuberculosis:réservoir homme • Mycobacterium bovis:réservoir bovin • Mycobacterium africanum:Afrique noir MYCOBACTERIES NON TUBERCULEUSESATYPIQUES • Présentes dans l’environnement sans danger pour l’homme • Responsable d’infections opportunistes chez les ID • Pays développés: recrudescence de la tuberculose (SIDA) • Nécessité d’identification des mycobactéries MYCOBACTERIUM LEPRAE

  3. CLASSIFICATION DE RUNYON • GROUPE O: Les bacilles tuberculeux • GROUPE I :Mycobactéries à croissance lente, photochromogènes • GROUPE II : Mycobactéries à croissance lente, scotochromogènes • GROUPE III : Mycobactéries à croissance lente, non chromogènes • GROUPE IV : Mycobactéries à croissance rapide, pigmentées ou non

  4. ASPECT MACROSCOPIQUE

  5. PRODUCTION DE PIGMENT • TECHNIQUE : Ensemencer deux tubes L et O avec une dilution 10-5, culture à 37°. Croissance sur tube L, illuminer tube O sous une lampe à fluoréscence • RESULTATS : Mycobactéries sans pigmentation: Souche non chromogène ( gp III) Mycobactéries pigmentant sans illumination: Souche scotochromogène (gp II) Mycobactéries pigmentant à la lumière: Souche photochromogène (gp I)

  6. IDENTIFICATION PAR LES TESTS BIOCHIMIQUES • Indispensables • Seuls à établir un diagnostic d’espèces • Applicables sur les colonies obtenues par culture • Mycobactéries tuberculosis complexe ≠ Atypiques

  7. NIACINE TEST • Principe: Recherche de la niacine ou acide nicotinique • Technique: R1: aniline à 4% dans alcool éthylique à 95° (fl brun à 4°) R2 :bromure de cyanogène à 10% dans ED (fl brun à 4°) • Mode opératoire: +1ml ED dans un tube de culture, laisser en contact 15min, reprendre 0.5ml dans un tube et ajouter 0.5ml R1 +0.5ml R2: col jaune • Résultats: M. tuberculosis: niacine +M. africanum: production variable M. bovis: Négatif Mycobactéries non tuberculeues: Négatif • NB: Tests sur bandelettes (DIFCO) remplace cette manipulation

  8. NIACINE TEST

  9. NIACINE TEST SUR BANDELETTES

  10. REDUCTION DES NITRATES • Techniques: R1: Sol de nitrate de Na 0.01M R2 : Hcl dilué R3 : sol de sulfaniline R4 : sol de alpha naphtylamine • Mode opératoire: Mettre en suspension des colonies dans la solution1, incuber 2 heures à 37°, ajouter une goutte R2, deux gouttes R3 et deux gouttes R4 • Résultats: Positif, virage de la coloration au rouge (intensité de la couleur: + jusqu’à 5+) M.tuberculosis: positifM.bovis et M. africanum: négatif Mycobactéries non tuberculeuses: négatif NB: Pour confirmer une réaction négative ajouter poudre de zinc

  11. TEST DE NITRATE

  12. THERMOSENSIBILITE DE LA CATALASE • TECHNIQUE: Deux tubes contenant une suspension bactérienne dans tampon phosphate, un tube à température ambiante, l’autre à 68°c pendant 20 min. Après refroidissement ajouter 0.5ml de H2O2 à 30% • RESULTAT: Positif, observation de bulles à la surface • La catalase est thermolabile pour les 3 espèces pathogènes, thermorésistante pour les atypiques

  13. BETA- GLUCOSIDASE • TECHNIQUE: Suspension de colonies de culture dans 0.5ml de sol. de para nitrophényl ß-D glucoside, 3h à 37° • RESULTAT: positif, apparition d’une coloration jaune M.tuberculosis:positif M. bovis: négatif Mycobactéries non tuberculeuses: négatif (groupe I variable)

  14. UTILISATION DU MILIEU LÖWENSTEIN-JENSENCONTENANT DIFFERENTS INHIBITEURS TECHNIQUE: Ensemencer avec 0.1ml de la dilution au 1/1000 de la suspension bactérienne, incuber 3 semaines à 37° • P. nitrobenzoate PNB à 500ug/ml: Sensible pour les M.de la tuberculose: • Hydroxylamine HYD à 250 ug/ml: Sensible pour les M. de la tuberculose • Acide thiophène 2 carboxylique (TCH) à 2 ug/ml: Résultats: M. tuberculosis: Résistant M. bovis: Sensible M. non tuberculeuse: Résistant • D-cyclosérine:Résistantavec BCG • Pyrazinamide PZA à 50 et 100ug/ml: Résistant avec bovis

  15. IDENTIFICATION DES PRINCIPALES MYCOBACTERIES

  16. TESTS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE • Différentiation génétique du MTBC et des atypiques • Extraction ADN bactérien de la culture • Amplification de la cible par PCR • Hybridation des amplicons aux sondes sur bandelettes • Révélation par un conjugué marqué et son substrat • Interprétation des signaux à l’aide d’une matrice

  17. INNO-Lipa MYCOBACTERIA®

  18. GenoType®MTBC M.tuberculosis BCG

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