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第二十一章 基因诊断与基因治疗

第二十一章 基因诊断与基因治疗. 第一节 基因诊断. 疾病的根本原因 : 疾病的各种表型的改变 是 基因的改变 造成的. 一、基因诊断 (Genetic Diagnosis) 的含义. 基因诊断 : 采用 分子生物学的技术方法 来分析受检者的 某一特定基因的结构 (DNA 水平 ) 或 功能 (RNA 水平 ) 是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。 是病因的诊断。. 二、基因诊断的原理和方法. 1 、基因诊断的原理： DNA 诊断 ---- 检测相关基因的机构及其表 达功能特别是 RNA 产物是否正常。

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第二十一章 基因诊断与基因治疗

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Presentation Transcript

  1. 第二十一章 基因诊断与基因治疗

  2. 第一节 基因诊断 • 疾病的根本原因: 疾病的各种表型的改变 是基因的改变造成的

  3. 一、基因诊断(Genetic Diagnosis)的含义 • 基因诊断: 采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构(DNA水平)或功能(RNA水平)是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。是病因的诊断。

  4. 二、基因诊断的原理和方法 1、基因诊断的原理： • DNA诊断----检测相关基因的机构及其表 达功能特别是RNA产物是否正常。 • RNA诊断----对表达产物mRNA质和量表 化的分析。

  5. 1、基因诊断的方法 • 核酸分子杂交技术 • 聚合酶链反应 (PCR) • 基因测序 • 基因芯片

  6. （1）DNA诊断 • 斑点杂交 • 等位基因特异寡核苷酸探针 (allele specific oligonucleotide, ASO) • PCR/单链构象多态性分析（SSCP） (single strand conformation polymorphism, SSCP) • 限制性内切酶谱分析法 • DNA限制性长度多态性 (restriction fragment length polymorphism, RLFP)分析

  7. PCR/单链构象多态性分析（SSCP） PCR产物变性后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳， 正常基因和变异基因的迁移位置不同， 可分析确定致病基因的存在。

  8. 5´ 3´ 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 MstⅡ酶切位点(GCTNAGG) 5´ 3´ 正常基因 1.15kb × 突变基因 1.35kb

  9. ﹣ + 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 1.35kb 1.15kb 0.2kb 正常人 突变携带着 患者

  10. （2）RNA诊断 • RNA印迹（Northen blot） 是检测基因是否表达、表达产物mRNA的大小及基因表达的效率。 • RT-PCR

  11. 三、基因诊断的应用 1、遗传疾病 2、感染性疾病 （1）病毒性感染 （2）细菌性感染 （3）寄生虫 （4）其他

  12. 3、恶性肿瘤 4、法医学中的应用 （1）DNA指纹分析（DNA fingerprinting） （2）短串联重复多态性分析 　　（short tandem repeat，STR）

  13. 遗传性疾病----DMD的分子诊断

  14. 遗传性疾病----DMD的分子诊断 • X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病,发病率 为1/3 500个男孩 • DMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2500Kb DMD基因的突变导致dystrophin缺陷 • 检测DMD基因的技术： Southern印迹、多重PCR

  15. DMD的基因检测 • 迪谢内肌营养不良 (DMD) 是一种高发病 率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗 传性疾病，在2500个活产男婴中即有一 个患者。 • 致病基因DMD的全长为250kb，有79个外 显子。 • DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失， 约占60%~70%。

  16. DMD基因外显子缺失的检测

  17. 感染性疾病的分子诊断

  18. 感染性疾病的分子诊断 定性或定量检测致病微生物的核酸， 已经用于病毒、细菌和寄生虫感染 的诊断。 动态、定量地检测病原体核酸能对 疗效判断和病情预后提供客观的依 据。

  19. SARS相关冠状病毒的分子诊断

  20. SARS相关冠状病毒的分子诊断 • 2003年4月，香港研究者Peiris等报 告了50 例SARS病人的临床表现和 病毒学研究结果证明，新冠状病毒 可能是SARS的致病原因。 （Lancet, 2003, 361: 9365) • 其它实验室陆续得出相同结论。

  21. 2003年4月，德国汉堡Bernhard- Nocht热带医学研究所学者 Drosten 等用随机扩增技术，获得长度为 300 bp的核苷酸序列。 • 根据这段序列，建立了检测新冠状 病毒的常规和实时定量PCR技术。（www.nejm.com.org on April 10, 2003）

  22. 引物和探针 • BNIoutS2--BNIoutAs BNI-1片段，189 bp BNIinS--BNIinAs BNI-1片段的内套片段，108bp • BNITMSARS1—BNITMSARAs2 BNITMSARP(荧光素标记的探针） 产物长度：77 bp

  23. 检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺 泡灌洗液 、血浆、粪便。 • 检测方法 1. 逆转录-巢式PCR 2. 逆转录-实时PCR

  24. 结 果 • 病人和接触者（具临床症状）的痰 液中用外套引物检测到了病毒。 • 病人的其它标本用套式PCR检测到 病毒。

  25. 有报道显示，在可能SARS病人 中， 病毒的检出率为100%。 • 在疑似SARS病人中的检出率为 23%。 • 所有健康接触者中未检测到病毒。

  26. 检测病毒的3种方 法（血清学检测、 病毒分离、PCR技术）中，PCR技 术的检出率最高。

  27. 讨 论 • 疾病的早期即可获得阳性结果（早 于血清转换期）。 • 特异性较高（SARS患者中的阳性 率约为80%，对照中的阴性率约为 98%~100%）。 • 现有的方法敏感性较差，阴性结果 不能排除病毒感染。

  28. 讨 论 • 痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道 排放是主要传播途径。 • 血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒 复制不仅发生于呼吸道。 • 病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，说明粪 便可能也是一种传播途径。 • 鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液， 提示不适合作为标本（有可能漏检）。

  29. SARS相关冠状病毒分子诊断中必须注意的问题 • 必须在规范的基因扩增实验室中进行。 • 应采取必要的质控规程，包括阳性对照 和阴性对照。 • 阳性结果时必须对原始样本重复检验或 者扩增基因的另一个片段或在另一个实 验室对同一样本进行检测。

  30. 其他感染性疾病的诊断 HBV病毒 HIV病毒

  31. PCR技术在细菌性食物中毒中的应用

  32. 简介 细菌性食物中毒具有下列特点： • 与饮食有密切关系，患者只局限在食用过同 一种食物的人群中，去掉原因食品后，不再有新患者； • 临床症状以急性胃肠炎为主要表现，症状基本相同； • 短时间内有多人发病； • 无人传染人的现象； • 有一定的地区性，主要与人们膳食习惯有关； • 有明显的季节性，主要发生在夏秋季节，气温高细菌易于繁殖和产生毒素； • 从病人与食物中可分离出相同的病原菌。

  33. 简介 • 细菌性食物中毒 感染型食物中毒：由于细菌污染食物后在其中 大量繁殖，人食入了含有大量活菌的食物 后，引起消化道感染而造成的中毒，如沙 门氏菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、链球 菌等。 毒素型食物中毒：由于细菌污染食物后在其中 繁殖并产生大量毒素，人食入含有大量毒 素的食物后引起的中毒，如肉毒中毒。

  34. 样品采集 • 剩余食物 • 炊事用具 • 呕吐物 • 粪便 • 外环境样品

  35. 常规检验程序(1-2星期) • 直接涂片、染色、镜检 • 活菌数测定（少数菌） • 选择适当的增菌 鉴别培养基进行分离培养 • 生化鉴定 • 血清学试验 • 毒素测定

  36. 沙门菌 志贺菌 O157 副溶血性弧菌 金黄色葡萄球菌 蜡样芽孢杆菌 霍乱弧菌 单核利斯特菌 化脓性链球菌 小肠结肠耶尔森氏菌 变形杆菌 空肠弯曲菌 产气荚膜梭菌 致腹泻性大肠杆菌 常见的致食物中毒的细菌

  37. PCR快速检测致食物中毒的细菌 选择性培养 基增菌 DNA提取 样品 增菌 PCR 直接处理

  38. M

  39. 肿瘤相关基因的检测

  40. 肿瘤相关基因的检测 肿瘤是由于遗传物质（肿瘤相关 基因）发生突变而导致的疾病。 肿瘤相关基因的突变只是增加了 个体对肿瘤的易感性而并不一定 马上产生肿瘤， 肿瘤的发生是一个多因素、多步骤 的过程。

  41. 生物芯片技术在今后的肿瘤发病机制研究和肿瘤的诊断等方面将发挥越来越显著的作用生物芯片技术在今后的肿瘤发病机制研究和肿瘤的诊断等方面将发挥越来越显著的作用

  42. P53导致肿瘤发生的 机制

  43. p53 Target Gene Array Total RNA from HeLa or NCI-H23 cells were reverse-transcribed into cDNAs in the presence of Biotin-dUTP. The biotin-labeled cDNA probes were then hybridized individually to the Human TranSignal p53 Target Gene Array.

  44. 法医学上的应用 个人认识 亲子鉴定 性别鉴定

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