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多聚酶链式反应（ PCR ）

多聚酶链式反应（ PCR ）. 一、实验目的. 了解 PCR 的基本原理，掌握 PCR 的基本操作技术. 二、实验原理. 多聚酶链式反应是在模板 DNA 、引物和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。 由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅速扩增. 二、实验原理. 1 、变性（ 94℃ ） ： 使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链 DNA 2 、退火（ 55℃ ） ： 引物和其互补的模板在局部形成杂交链 3 、延伸（ 72℃ ） ：

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多聚酶链式反应（ PCR ）

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Presentation Transcript

  1. 多聚酶链式反应（PCR）

  2. 一、实验目的 了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术

  3. 二、实验原理 • 多聚酶链式反应是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。 • 由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增

  4. 二、实验原理 1、变性（94℃） ： 使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链DNA 2、退火（55℃）： 引物和其互补的模板在局部形成杂交链 3、延伸（72℃）： 通过Taq DNA聚合酶使4种单核苷酸从引物的3`端开始掺入，沿模板从5`向3`端方向延伸，合成与模板DNA的互补链。

  5. 二、实验原理 以上3步为一个循环，每一循环的产物可作为下一个循环的模板，反复进行这一循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增，循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA分子经20次循环扩增后可达106。

  6. 双链DNA分子

  7. 循环1 双链断开

  8. 循环1 模板与引物结合 Taq Taq

  9. 循环1 Taq Taq

  10. 循环1

  11. 循环1

  12. 双链断开 循环2

  13. 模板与引物结合 Taq Taq Taq Taq 循环2

  14. 循环2

  15. 94℃变性 双链断开 循环3

  16. Taq Taq Taq Taq Taq Taq Taq 循环3 Taq

  17. 循环3

  18. 循环n

  19. 三、实验材料、仪器及试剂 • 水稻总DNA • PCR仪，台式离心机，电泳仪，电泳槽 • 2ml离心管架，移液枪，1. 5ml离心管，0.2ml离心管，枪头 • dNTP，Taq酶，引物一对（RM1 F，RM1 R），10×PCR反应缓冲液，灭菌双蒸水，

  20. 四、实验步骤 1、PCR反应混合液的制备 2μl DNA 0.4μl dNTP（10mM） 1.5μl 引物F（2 μM） RM1 F 1.5μl 引物R（2 μM） RM1 R 0.3μl Taq酶（5U/μl） 2.0μl反应缓冲液（含15mM MgCl2） 13μl ddH2O 混匀，放入PCR仪中开始反应

  21. 四、实验步骤 1、PCR反应混合液的制备（n为反应数） n ×2μl DNA n ×0.4μl dNTP（10mM） n ×1.5μl 引物F（2 μM） RM1 F n ×1.5μl 引物R（2 μM） RM1 R n ×0.3μl Taq酶（5U/μl） n ×2.0μl反应缓冲液（含15mM MgCl2） n ×13μl ddH2O 混匀，放入PCR仪中开始反应

  22. 2、PCR反应程序设计如下 94 ℃，预变性5分钟 94 ℃，变性1分钟 55 ℃，退火1分钟 30个循环 72℃，延伸1分钟 72℃，延伸5分钟

  23. 五、注意事项 • 所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染 • 所有PCR试剂中用的水都应该是最高质量的双蒸水 • 所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意然后再分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性 • PCR管和枪头都一次性使用

  24. 六、作业 写出PCR的反应原理及实验步骤

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