蛋白质纯化技术

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Company Logo 蛋白质纯化技术盐析，等电点沉淀透析，超滤密度梯度离心凝胶过滤层析离子交换层析亲和层析

Company Logo 常用中性盐：硫酸铵，硫酸钠，氯化钠

Company Logo 蛋白质纯化技术盐析，等电点沉淀透析，超滤密度梯度离心凝胶过滤层析离子交换层析亲和层析

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Company Logo 蛋白质纯化技术蛋白质纯化技术 • 切向流过滤  切向流过滤（Tangential Flow Filtration ，简称TFF）其概念是相对于常规过滤（Normal Flow Filtration ，简称NFF ）而言的。  切向流过滤则是指液体的流动方向是平行于膜表面的，在压力的作用下只有一部分的液体穿过滤膜进入下游，这种操作方式也有人称之为“错流过滤”（Cross Flow Filtration）。

Company Logo 蛋白质纯化技术切向流过滤

Company Logo 蛋白质纯化技术 • 切向流工艺优化参数 切向流流量 跨膜压（TMP） 透出液控制 膜面积 透析条件

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Company Logo 蛋白质纯化技术具有透过液控制的切向流过滤系统示意图

Company Logo 蛋白质纯化技术盐析，等电点沉淀透析密度梯度离心凝胶过滤层析离子交换层析亲和层析高压液相层析

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Company Logo 蛋白质纯化技术盐析，等电点沉淀透析密度梯度离心凝胶过滤层析离子交换层析亲和层析

Company Logo 蛋白质层析技术 • 层析技术 层析分离又称色谱分离（Chromatographic Resolution, CR）或色层分离。 根据物理化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相（固定相和流动相）中。 在固定相和流动相之间经过多次分配以不同的速率移动，从而达到分离的目的。

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Company Logo 蛋白质层析技术 • 层析技术基本原理 1. 吸附层析混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物得到分离。 2. 分配层析其固定相和流动相都是液体，其原理类似于液液萃取，利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。 3. 凝胶过滤层析由于大分子和小分子在通过色谱柱时，所通过得路径不同（大分子进入空隙，小分子进入孔内），流出色谱柱的时间不同，从而得到分离。

Company Logo 蛋白质层析技术 • 层析技术分类 1.按分离机理不同分类吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析 2.按固定相形状不同分类柱层析、纸层析、薄层层析 3.根据流动相的物理形态不同分类气相层析、液相层析、超临界层析 4.根据层析分离的规模大小分类分析型（一次进样量<10 mg）、半制备型（一次进样量10-50 mg）、制备型（一次进样量0.1-10 g）和工业生产型（> 20 g/d）

Company Logo 蛋白质层析技术 • 凝胶过滤层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶层析、凝胶渗透层析等。利用凝胶过滤介质为固定相，根据物料中溶质相对分子质量的差异的液相色谱法。

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Company Logo 蛋白质层析技术 • 凝胶特性参数 排阻极限 (exclusion limit) 分级范围 (Fractionation range) Sepharose 6 Fast Flow，它的分级范围为10KD-4000KD 吸水量 (Water regains) 凝胶粒径 Sepharose 6 Fast Flow，它的颗粒大小为45-165um 床体积 (Bed volume ) 空隙体积 (Void volume)

Company Logo 蛋白质层析技术 • 凝胶介质的种类 按基质组成主要可以分为：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶以及由两种物质混合形成的如琼脂糖-葡聚糖混合凝胶、聚丙烯酰胺-葡聚糖混合凝胶等。 按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率又可分为：标准凝胶介质：颗粒尺寸较大（一般为100~250 μm），机械强度相对较低高效凝胶介质：颗粒尺寸小（一般为5~50 μm），机械强度相对较高，柱效明显提高，适合于高分辨率或更快的分离。

Company Logo 蛋白质层析技术 • 琼脂糖凝胶由β-D-半乳糖和3,6-脱水 -L-半乳糖两种单糖交替连接而成。其商品名有三种 ①Sehparose ②Sepharose CL ③Superose

Company Logo • Sepharose 由于没有交联剂的存在，决定凝胶颗粒网孔大小的因素是形成凝胶时琼脂糖的含量。分离范围颗粒大小特性/应用 Sepharose 2B Sepharose 4B Sepharose 6B

Company Logo 蛋白质层析技术 • Sepharose Fast Flow Sepharose 6 Fast Flow 分离颗粒范围大小特性/应用 pH 稳定性耐压最高流速（Mpa） (cm/h) Sepharose 4 Fast Flow

Company Logo 蛋白质层析技术 • Sepharose CL Sepharose CL系列凝胶在颗粒直径、分级范围方面与Sepharose系列完全相同在pH稳定范围、机械强度（流速）及温度稳定性等方面得到了很大的改进 • Superose 具有很好的机械稳定性、化学稳定性及热稳定性，适合于高速分离过程。

cross-linked agarose dextran cross-section from Superdex™ particle Company Logo 蛋白质层析技术 • 复合结构凝胶 Sephacryl HR系列凝胶：是由烯丙基葡聚糖通过N, N′-亚甲基双丙烯酰胺交联而成。 Superdex系列凝胶：是将葡聚糖与高交联度的琼脂糖颗粒共价结合而形成的。 • 2 • 3 • 34

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Company Logo 蛋白质层析技术 • 凝胶过滤层析的操作过程 • 1. 装柱 • 2. 平衡（equilibrium) • 3. 上样(loading) • 4. 洗脱(elution) • 5. 凝胶再生和保养

Company Logo 蛋白质层析技术 • 凝胶过滤层析的影响因素 1. 凝胶介质的选择一般排阻极限应大于目标分子，而分级范围应当涵盖目标分子的大小。 2. 层析柱的选择如用凝胶过滤层析法分离蛋白质，层析柱的长度通常为内径的25~40倍。 3. 上样量分析型为1-2%床体积，制备型为5-30%床体积。对于蛋白质的分级分离，上样量通常为柱体积的2%~5%。 4. 洗脱流速

Company Logo 蛋白质层析技术 • 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography) 以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力（静电作用力）的差别而进行分离的一种层析方法。

载体官能团可交换离子 Company Logo 蛋白质层析技术

Company Logo 蛋白质层析技术 • 离子交换剂种类强阳离子（酸）交换剂（-SO3H）阳离子交换剂弱阳离子（酸）交换剂（-COOH ）强阴离子（碱）交换剂（-N(CH3)3）阴离子交换剂弱阴离子（碱）交换剂（-NH2） • 离子交换剂的基质疏水性树脂--- 聚苯乙烯树脂亲水性聚合物--- 纤维素(Cellulose) 球状纤维素(Sephacel) 葡聚糖 (Sephadex)琼脂糖(Sepharose)

Company Logo 蛋白质层析技术 • 根据目的蛋白的pI选择合适的缓冲液pH • pH=pI时，蛋白质表面电荷为零； • pH<pI时，蛋白质带正电荷； • pH>pI时，蛋白质带负电荷。

目标物 Company Logo 蛋白质层析技术 • 亲和层析

Company Logo 蛋白质层析技术 • 亲和层析载体琼脂糖，聚丙烯酰胺，硅胶 • 亲和层析配体酶-底物类似物，抗体抗原，过渡金属离子等 • 亲和层析载体与配体的链接需要进行化学反应使载体上化学集团处于活化状态 • 连接臂增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子有效的亲和结合。

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Company Logo 2. 凝胶介质的种类小结（＊数字越小，表示介质交联度越大，分级范围越小。）（1）葡聚糖凝胶（Sephadex G-数字） ①Sepharose（2B,4B,6B） ②Sepharose CL（2B,4B,6B） ③Superose (6,12) （＊数字表示琼脂糖含量，数字越大，分级范围越小。）凝胶过滤介质（2）琼脂糖凝胶 ①Sephacryl HR（S-数字 HR）（3）复合结构凝胶 ②Superdex（peptide，30，75，200）（＊数字越小，表示介质交联度越大，分级范围越小。）

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