Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique

1. 19 septembre 2007 Luc Paillard, CNRS UMR 6061 Luc.paillard@univ-rennes1.fr Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique

2. Que sont les régulations post-transcriptionnelles? AAAAAA AAAAAA

3. Que sont les régulations post-transcriptionnelles? (Régulation de la stabilité des protéines) Régulation de la traduction AAAAAA Régulation de la stabilité des ARNm AAAAAA Un niveau de contrôle de la concentration cellulaire en chaque protéine

4. « How is gene expression controlled in eukaryotes? As in prokaryotes, control is exerted primarily at the level of transcription » Lubert Stryer, Biochemistry III, 1988

5. Des altérations de facteurs de régulation post-transcriptionnelle provoquent des perturbations phénotypiques Importance du contrôle post-transcriptionnel chez les eucaryotes Des pathologies humaines sont associées à des défauts de contrôle post-transcriptionnel

6. Des altérations de régulations post-transcriptionnelles provoquent des perturbations phénotypiques Mise en place de l’axe antéro-postérieur chez la drosophile

7. Des pathologies humaines sont associées à des défauts de contrôle post-transcriptionnel Thalassémies (a ou b) et instabilité des ARNm a ou b globine Oncogenèse et stabilisation d’ARNm de cytokines/proto-oncogènes

8. Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) :niveau d’accumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm

9. Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) :niveau d’accumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm « Traductome » (gradient) :Accumulation des ARNm dans les polysomes Traduction des ARNm

10. Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) :niveau d’accumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm « Traductome » (gradient) :Accumulation des ARNm dans les polysomes Traduction des ARNm Protéome (2DE, MS et dérivés) :niveau d’accumulation des protéines Traduction, stabilité des protéines

11. Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) :niveau d’accumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm « Traductome » (gradient) :Accumulation des ARNm dans les polysomes Traduction des ARNm Protéome (2DE, MS et dérivés) :niveau d’accumulation des protéines Traduction, stabilité des protéines Relations Transcriptome/traductome/Protéome

12. 1. Levures en phase de croissance Marquage métabolique (Met-35S) des cellules Séparation des protéines par 2DE Quantification des spots, identification Niveaux d’expression de 106 protéines Gygi et al MCB 1999 19, 1720

13. 1. Levures en phase de croissance Données de SAGE Niveaux d’expression des ARNm correspondants Gygi et al MCB 1999 19, 1720

14. 1. Levures en phase de croissance Corrélation entre niveau d’expression des ARNm et des protéines Gygi et al MCB 1999 19, 1720

15. 1. Levures en phase de croissance Corrélation entre niveau d’expression des ARNm et des protéines Corrélation très mauvaise! Gygi et al MCB 1999 19, 1720

16. 2. Réponse à un changement de milieu de culture Culture de levures en galactose Transfert en galactose ou éthanol Ratio Gal/Eth mesuré pour 245 produits de gènes : protéine (ICAT : MS en conditions quantitatives), ARNm (microarray) log du ratio des protéines=f(log du ratio des ARNm) (log=0 pour un produit de gène dont l’abondance ne change pas) Griffin et al MCP 2002 1, 323

17. 2. Réponse à un changement de milieu de culture R2=0.21! Griffin et al MCP 2002 1, 323

18. Conclusion • Les régulations post-transcriptionnelles sont un niveau • MAJEUR de régulation de l’expression génétique • 2. (En conséquence, les analyses transcriptomiques • peuvent être insuffisantes)

19. Bref survol des modalités de régulations post-transcriptionnelles Structure de l'ARNm eucaryote : AUG STOP 5' AAA….AAA 3' ORF 5'UTR 3'UTR Coiffe Queue poly(A) Régions non codantes

20. Rappels sur la traduction eucaryote Initiation Recrutement de la petite sous-unité ribosomique (40S) à l ’extrémité 5 ’ Scanning jusqu ’à la rencontre de l ’AUG initiateur Jonction de la grosse sous-unité (60S) = ribosome (80S) Elongation Lecture codon par codon Terminaison Relargage du peptide Le ribosome? Influence du contexte du codon stop

21. La 5’UTR contrôle la traduction 1, Les uORF (upstream ORF) 5’UTR de l’ARNm Gcn4 de levure : 4 uORF avant l’ATG initiateur Réinitiation possible « dans certaines conditions » en 3’ d’une uORF Ces conditions contrôlent la traduction de GCN4 Gaba et al EMBO J 2001 20, 6453

22. La 5’UTR contrôle la traduction 1, Les uORF (upstream ORF) Plusieurs (nombreux) ARNm contiennent des uORF, même chez les métazoaires Fonction???

23. La 5’UTR contrôle la traduction 2, Fixation d’une protéine dans la 5’UTR La fixation d’une protéine à proximité de la coiffe (<40nt) inhibe la traduction Exemple : Contrôle de la traduction de la ferritine par la séquence IRE et la protéine IRP

24. La 5’UTR contrôle la traduction 3, Les IRES (Internal Ribosome Entry Site) Initiation indépendante de la coiffe (et de eIF4E) Traduction de certains ARNm quand les autres sont réprimés (stress, cycle cellulaire…)

25. La 3’UTR contrôle la stabilité 1, Le récepteur de la transferrine L'IRP (Iron Response Protein) lie l'IRE (Iron Response Element) si la concentration cellulaire de fer libre est faible L’ARNm récepteur de la transferrine contient 5 IRE dans sa 5’UTR (et un site de clivage endonucléolytique) Complexe IRE-IRP : inhibition de dégradation Contrôle de la concentration intracellulaire en fer libre

26. La 3’UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U Rich Element) Mise en évidence : 1986. ARNm de cytokines, proto-oncogènes… Cinétique de dégradation, en Northern, d’un ARNm rapporteur sous contrôle d’un promoteur inductible Sans ARE Avec ARE Xu et al. MCB 2001 21, 6960

27. La 3’UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U Rich Element) 3 classes d’ARE

28. La 3’UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U Rich Element) Les ARE agissent en fixant une protéine (ARE-BP) hnRNPD/AUF1, HuR, TTP… Effet positif ou négatif de la fixation de la protéine

29. La 3’UTR contrôle la stabilité 3, La queue poly(A) Un ARNm polyadénylé est généralement plus stable qu’un ARN désadénylé

30. La 3’UTR contrôle aussi la traduction 1, Les ARE (A/U Rich Element) Vecteur vide EGFP-ARE EGFP Transfection d’un plasmide codant un ARN EGFP (avec ou sans ARE dans la 3’UTR) Mesure de l’ARN (Northern) et de la protéine (western) EGFP Grosset et al. JBC 2004 279, 13254

31. La 3’UTR contrôle aussi la traduction 2, La queue poly(A) +/-cap Luciferase +/-poly(A) Incubation dans extrait de levure Même expérience en présence d ’anticorps anti PABP Mesure de luminescence Pas de stimulation de la traduction par la queue poly(A) Tarun et Sachs (1995) Genes Dev 9, 2997

32. La 3’UTR contrôle aussi la traduction 2, La queue poly(A) +/-cap Luciferase +/-poly(A) Transfection dans les levures Mesure de luminescence "wt" Dpab1 La queue poly(A) stimule la traduction de façon dépendante de la PAB1 Searfoss et al 2001, MCB 21, 4900

33. Mais tout cela est lié! 1, ARE et état d’adénylation Cinétique de dégradation, en Northern, d’un ARNm rapporteur contenant un ARE sous contrôle d’un promoteur inductible Diminution de taille avant dégradation Peng et al. MCB 1996 16, 1490

34. Mais tout cela est lié! 2, ARE, état d’adénylation, traduction, stabilité… + ARE-BP STOP AUG 5' AAAA...AAAAA ARE - Ri + (et c’est encore pire…)

35. La 3’ UTR contrôle la traduction ET la stabilité Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Et alors? miRNA RNAi siRNA Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

36. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Mécanismes biochimiques Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

37. Biosynthèse des miRNA Reconnaissance d’un ARN double brin par Argonaute! Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

38. Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt : Conséquence : inhibition de la traduction de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez l’animal Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

39. Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

40. Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante… … Mais si l’on apporte un ARN double brin parfaitement complémentaire d’un ARNm cible chez l’animal, cela provoque sa dégradation… voie « siRNA » chez l’animal

41. Mise en évidence du RNAi Injection d'ARN sens, antisens ou double brin dans la gonade Phénotype de la descendance? Prix NOBEL 2006 Fire et al. (1998) Nature 391, 806

42. Reprenons… miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génome de la cellule (sous forme d’un précurseur qui est maturé) Environ 200 chez l’humain S’apparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe sa traduction (animal), ou s’apparie parfaitement et provoque sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…) En général, un miRNA s’apparie aux 3’UTR d’un ou plusieurs ARNm Une 3’UTR peut être liée par plusieurs miRNA siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par l’expérimentateur dans une cellule animale S’apparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation

43. Le RNAi, un mode de régulation post-transcriptionnel au service de l’expérimentateur Application en thérapeutique? Downward BMJ  2004 328, 1245