食品微生物学 实验

1. 食品微生物学实验

2. 课程简介： 本实验课程主要面向“食品科学与工程”、“食品质量与安全”等专业本科生，以专业基础课程《食品微生物学》为理论基础，是对学生进行独立的相关微生物研究能力培养的重要环节。共有学时数34学时，教学内容内容包括： “细菌、酵母菌、放线菌等的形态观察”、“培养基的制备和灭菌”等。实验教学包括设计型、技能型和综合型实验内容，可提高学生的动手能力和解决实际问题的能力。

3. 目 录 • 实验1 显微镜的使用 • 实验2 细菌的形态观察 • 实验3 酵母菌、放线菌形态的观察 • 实验4 霉菌的形态观察 • 实验5 培养基的制备和灭菌 • 实验6 微生物的分离与接种 • 实验7 环境因素对微生物生长发育的影响 • 实验8 细菌鉴定中常用的系生化反应试验 • 实验9 罐头食品的商业无菌检验 • 实验10 几种水产品中的无菌检验 • 实验11 水产品中腐败微生物的分离、纯化及鉴定 • 实验12 红树林环境中抗菌微生物的筛选 • 实验13 果酒的制备实验 • 实验14 乳酸菌分离纯化以及酸奶的研制

4. 实验1 显微镜的使用 【实验目的】 1．了解普通光学显微镜的各部分构造、性能和基本原理。 2．学会显微镜的正确使用方法，了解显微镜的维护和保养方法。

5. 【实验原理】 显微镜的构造：机械部分与光学部分

6. 显微镜的成像原理 光线在穿过折射率不同的介质时发生折射

7. 介质的折射率对光线通路的影响

8. 【实验内容与步骤】 一、实验材料 1．显微镜，载玻片，盖玻片。 2．细菌、霉菌、酵母菌标本片。 3．香柏油、二甲苯、察镜纸等。

9. 二、显微镜的操作 正确放置显微镜 调节照明 低倍镜观察 确定目标 高倍镜观察 油镜观察 镜头的维护 注意：显微镜结构精密，使用时必须细心， 严格按操作步骤进行，具体细节参考实验指导书。

10. 三、 油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。

11. 使用油镜按下列步骤操作 • 先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。 • 在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 • 从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升（或镜筒下降），使油镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触（约0.2mm）。 • 用粗调节旋钮将载物台慢慢下降，当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。

12. 观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2~3下即可，（注意向一个方向擦拭）。观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2~3下即可，（注意向一个方向擦拭）。 • 转动物镜转换器，将各部分还原，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。 注意：使用油镜时，在通过目镜观察时，切勿用粗调上升镜台来调节焦距，以免压碎玻片，损坏镜头。

13. 【思考题】 1、如何区别显微镜的低倍镜、高倍镜和油镜？ 2、油镜和高倍镜在使用时应注意哪些问题？ 3、观察完毕后，如何维护显微镜？

14. 实验2细菌的形态观察 【实验目的】 • 1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。 • 2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。 • 3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征。学会初步鉴别微生物的种类的方法。

15. 【实验原理】 1、简单染色法原理 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

17. 2、革兰氏染色法原理 电镜照片

18. 3、芽孢染色原理 细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。

19. 4、荚膜染色原理 荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来 细菌荚膜

20. 5、鞭毛染色法原理 细菌鞭毛直径为10-12nm，超过了光学显微镜的分辨能力。所以染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。 染色成功的关键： 一、必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色； 二、是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动和细菌本身的运动。

22. 【实验内容与步骤】 涂片 固定 干燥 1、简单染色过程 染色 水洗、吸干 镜检

23. 革兰氏阳性菌（左）和革兰氏阴性菌（右） 细胞壁结构的比较

24. 2、革兰氏染色过程 涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95%酒精,30s）→番红复染（30秒）→干燥→镜检 阳性菌：紫色 阴性菌：红色

25. 革兰氏染色要点 • 初染：用结晶紫，染色1分钟，水洗 • 媒染：加碘液覆盖1分钟后水洗 • 脱色：连续滴加95％乙醇，约30秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗 • 复染：加番红染色1分钟，水洗 • 干燥 • 镜检：先低倍镜，后油镜观察。 • 注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。

26. 大肠杆菌（G－）

27. 枯草杆菌（G+） 金黄色葡萄球菌枯草杆菌（G+）

28. 3、芽孢染色过程 细菌芽孢

29. 操作方法 • 用枯草杆菌涂片、干燥、固定。 • 在涂菌处滴加5％的孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾5－6分钟。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗。 • 0.5％番红复染1分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。

30. 4、悬滴法 ◆在盖玻片上滴小半滴无菌水。 ◆以无菌操作挑菌，接种环在水上轻点几下。 ◆将盖玻片迅速翻转置于凹玻片上即可观察。

31. 5、菌落特征的观察

32. 细菌菌落特征图

33. 实验报告 • 1．绘出枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的个体形态图，并注明三种细菌的革兰氏染色的反应性。 • 2.列表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等三种细菌的菌落特征。

34. 思考题 1.革兰氏染色法涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当，为什么？ 2.为什么要用培养24小时内的菌体进行革兰氏染色？ 3.鞭毛染色为何有那么多要求？ 4.菌体荚膜的成分是什么？为何常用负染色法？ 5.芽孢染色为何要加热或延长时间？

35. 实验内容与原理 简单染色法原理 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

37. 涂片 固定 干燥 简单染色过程 染色 水洗、吸干 镜检

38. 革兰氏染色法原理 电镜照片

39. 革兰氏阳性菌（左）和革兰氏阴性菌（右） 细胞壁结构的比较

40. 革兰氏染色过程 涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95%酒精,30s）→番红复染（30秒）→干燥→镜检 阳性菌：紫色 阴性菌：红色

41. 革兰氏染色要点 • 初染：用结晶紫，染色1分钟，水洗 • 媒染：加碘液覆盖1分钟后水洗 • 脱色：连续滴加95％乙醇，约30秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗 • 复染：加番红染色1分钟，水洗 • 干燥 • 镜检：先低倍镜，后油镜观察。 • 注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。

42. 大肠杆菌（G－）

43. 枯草杆菌（G+） 金黄色葡萄球菌枯草杆菌（G+）

44. 芽孢染色原理 细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。

45. 细菌芽孢

46. 操作方法 • 用枯草杆菌涂片、干燥、固定。 • 在涂菌处滴加5％的孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾5－6分钟。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗。 • 0.5％番红复染1分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。

47. 荚膜染色原理 荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来 细菌荚膜

48. 鞭毛染色法原理 细菌鞭毛直径为10-12nm，超过了光学显微镜的分辨能力。所以染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。 染色成功的关键： 一、必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色； 二、是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动和细菌本身的运动。

50. 悬滴法 ◆在盖玻片上滴小半滴无菌水。 ◆以无菌操作挑菌，接种环在水上轻点几下。 ◆将盖玻片迅速翻转置于凹玻片上即可观察。