Autore: Giovanni Batignani

1. Scopo della Tesi: DIRE INTRODUZIONE Ultrafast dynamics in photoexcitedNeuroglobinrevealedby Femtosecond Stimulated Raman Scattering Relatore: Tullio Scopigno Autore: Giovanni Batignani

2. Emoproteine e Neuroglobina Le Emoproteine costituiscono una delle più importanti famiglie di proteine. sono presenti in tutti gli organismi viventi e mostrano di possedere un ampio panorama di funzioni biologiche. Il nucleo di ogni emoproteina è costituito da uno ione di ferro, che ne determina le funzionalità biologiche. Funzione biologica ↔formare e rompere legami Infatti, grazie ad esso sono in grado di legare sia piccoli ligandi gassosi, come O2, NO o CO, sia specie di amminoacidi, come Istidina o Metionina. Specie deoxyesacoordinata Specie deoxypentacoordinata ACCENNARE AD ALCUNE FUNZIONI BIOLOGICHE… Amminoacidi Ligandogassoso (O2, CO, NO) Studiare i processi di formazione e distruzione dei legami significa studiare processi che avvengono su scale molto rapide  PUMP-PROBE ULTRAVELOCE, in grado di fornire informazioni sulle dinamiche vibrazionali e con alta risoluzione Heme Specie exacoordinate e pentacoordinate: problema apertonon sappiamo cosa la fotoeccitazione possa generare nella neuroglobina Ferro

3. Dinamica Ultraveloce Funzionamento del Pump probe Tecnica Pump Probe Studiare dinamiche di campioni fotoeccitati ∆t<1ps

4. Dinamica Ultraveloce Time ResolvedResonanceRaman (TR3) Neuroglobinadeoxy Citocromo c Fotolisi della Metionina Jean-Louis Martin et al. 2007 “…However, such studies are extremely challenging for the physiologically relevant ligand oxygen and have not been reported yet, even for the well studied oxygen carriers myoglobin and hemoglobin, presumably at least in part because of technical difficulties” “…Because of the decreased spectral resolution in the subpicosecond Raman experiments, lines in these spectra are broader than in the steady-state spectra obtained with cw excitation.” ???? Stati transienti ?? δω≈10cm-1 δt=2ps

5. Dinamica Ultraveloce Assorbimento Transiente (TA) “Transient spectra indicate the formation of a 5-c domed species upon photoexcitation of the 6-c species, and thus photodissociation of an internal residue. The process appears similar to the way small ligands like CO can be photodissociatedfrom ferrous heme-His-CO complexes. As, in contrast to small gaseous ligands, the internal ligands are restrained to heme proximity, full rebinding is observed on the picosecond time scale for allproteins.”

6. FemtosecondStimulatedRamanScattering Raman Pulse Raman Probe Energy Photochemical Pump Raman Probe Raman Pulse “Reaction” coordinate Timeline Actinic Pum ∆t Risoluzionetemporaleillimitata Raman spontaneo “transform limited” δωδt>15ps·cm-1 RamanPulse

7. FemtosecondStimulatedRamanScattering Raman Pump WL Probe Timing cycle – 1 mstimebase: WLCONONONON …. RAMAN PULSEON OFFON OFF …. PHOTOCHEM PUMP ON ON OFFOFF …. FSRS Setup Raman Pulse WLG

8. FemtosecondStimulatedRamanScattering

11. Conclusioni Sono ottenute misure che permettono di risolvere un'importante controversia presente in letteratura sulla dinamica delle emoproteine. Tradizionalmente esperimenti di assorbimento risolto in tempo avanzavano due ipotesi contrastanti fra loro: dopo un decadimento quasi istantaneo (meno di 50fs) da uno stato elettronico eccitato, la prima ipotesi predice l'esistenza di stati elettronici transienti, mentre la seconda ipotesi l'esistenza di uno stato elettronico caldo (cioè con diversi livelli vibrazionali eccitati). I dati raccolti nella tesi indicano chiaramente una dinamica di "hot bands", evidenza sperimentale della seconda ipotesi. E’ stato possibile correggere alcuni risultati sulla dinamica della Neuroglobina presenti in letteratura ed errati. Campionando lo spettro Raman a diverse lunghezze d'onda e con diversi ritardi temporali è verificata l'assenza della risonanza della ferro-istidina; quest'ultimo è un modo caratteristico presente solamente in caso di fotolisi. Dato che il setup sperimentale impiegato è in grado di risolvere chiaramente questa risonanza (come abbiamo verificato per campioni in cui è già stata verificata la presenza di fotolisi), è possibile fornire una verifica semplice e diretta dell'assenza di fotolisi del ligando assiale nella Neuroglobinadeoxy. Risultati ottenuti

12. Conclusioni Prospettive di ricerca future