Correction du Contrôle continu 2007 Durée: 2 heures

Correction du Contrôle continu 2007 Durée: 2 heures Sujet proposé par Sébastien BLOYER d’après Viré et al (2006), Nature (439)16-871-874 et Kirmizis et al (2004), Genes & Dev (18) 1592-1605.

Question 1(10 points). Donnez la définition du terme épigénétique dans le cadre de la régulation de l’expression des gènes. Quelle(s) différence(s) y a-t-il entre génétique et épigénétique ? A quel(s) niveau(x) agissent les mécanismes épigénétiques ? (1 page maximum)

1- Dans les cellules U2OS, EZH2 est exprimé: - Présence de transcrits EZH2 par RT-PCR - Présence de protéine EZH2 par WB 2- Dans les cellules U2OS traitées par un ARNi ciblant EZH2 on observe que le gène EZH2 est inactivé: - Absence de transcrits EZH2 par RT-PCR - Absence de protéine EZH2 par WB CONCLUSION #1: EZH2 est exprimé dans les cellules U2OS et l’ARNi EZH2 permet d’inactivé spécifiquement le gène EZH2 dans les cellules U2OS car un ARNi ciblant la GFP n’a aucun effet. 3- Le gène MYT1 semble réprimé dans les cellules U2OS 4- Cette répression est levée dans les cellules U2OS traitées par un ARNi ciblant EZH2 car on observe bcp plus de transcrit MYT1 CONCLUSION #2: EZH2 réprime l’expression/transcription du gène MYT1 dans les cellules U2OS.

Question 3(5 points). Rappelez brièvement le but ainsi que les différentes étapes de la technique d’immunoprécipitation de chromatine. Analysez la figure 2B. Pour quelle raison avoir utilisé des anticorps anti-H3K9me3, anti-Histone H3 et anti-ARN polymérase II ? (1/2 page) But: Analyser les interactions protéine-ADN in vivo

Fixation des cellules par le HCHO + SLOT/DOT Blot

Analysez la figure 2B. Pour quelle raison avoir utilisé des anticorps anti-H3K9me3, anti-Histone H3 et anti-ARN polymérase II ? (1/2 page) 1- La protéine EZH2 se fixe en amont (-800/-2000), en aval (-200/+600) et au niveau (+1) du promoteur du gène MYT1. 2- On observe que la lysine 27 de l’histone H3 est tri-méthylée dans ces même régions

Pour quelle raison avoir utilisé des anticorps anti-H3K9me3, anti-Histone H3 et anti-ARN polymérase II ? 3- anti-H3K9me3 : Témoin négatif de l’expérience (H3K9me3 étant une marque épigénétique associée à l’hétérochromatine) 4- anti-Histone H3: Témoin positif de l’expérience 5- anti-ARN Pol II: Rapporteur de l’activité transcriptionelle

1- Dans les cellules traitées avec l’ARNi EZH2 on observe pas de H3K27me3 en aval du promoteur. CONCLUSION #1 (+ cours): EZH2 est une protéine a activité histone methyltransférase (HMTase) dont la fonction est de triméthylé spécifiquement la lysine 27 de l’histone H3. 2- On observe la fixation de l’ARN Pol II en aval du promoteur. CONCLUSION #2: Ceci est en accord avec les résultats de la figure 1 (le gène MYT1 est déréprimé dans les cellules traitées avec l’ARNi EZH2) puisque le gène MYT1 est transcrit (présence de l’ARN Pol II)

Question 5(5 points).Quel est le but de l’expérience présentée dans la figure 3 ? Interprétez les figures 3 et 4. Quelle(s) principale(s) conclusion(s) pouvez-vous en tirer ? (1 page maximum)

CONCLUSION: Le(s) complexe(s) immuno-précipité(s) par l’anticorps anti-EZH2 possède(ent) une activité ADN-méthyltransférase (de maintient). 2 hypothèses: 1- C’est une activité intrinsèque de la protéine EZH2 2- Cette activité est indirecte et dépend des protéines immunoprécipitées avec EZH2

Expérience de co-immunoprécipitation (CoIP): - EZH2 est immunoprécipitée par les anticorps anti-DNMTs - les DNMTs sont immunoprécipitées par l’anticorps anti-EZH2 CONCLUSION: EZH2 et les DNMTs interagissent ensemble in vivo. Possibilité d’un complexe protéique EZH2/DNMTs Ce complexe pourrait avoir une activité de méthylation de l’ADN de novo (DNMT1) et de maintient (DNMT3a/b, cf. Figure 3) L’hypothèse #2 formulée précédemment (2- Cette activité dépend des protéines immunoprécipitées avec EZH2) est favorisé. Des expérience complémentaires sont nécessaire afin infirmer l’hypothèse #1 (activité ADN méthyltransférase intrinsèque d’EZH2).

1- Dans les cellules traitées avec l’ARNi EZH2 on observe une baisse de la méthylation de l’ADN d’environ 50% au niveau de l’îlot CpG localisé en amont du promoteur MYT1 2- Elle est 3 fois plus importante lorsque EZH2 est surexprimée 3- Cette activité dépend de la présence du domaine SET d’EZH2

CONCLUSION: La méthylation de l’ADN au niveau du gène MYT1 dépend de la présence de l’HMTase EZH2. Cette dernière est necessaire! Elle dépend également du domaine SET de la protéine EZH2. Hypothèse: c’est le domaine SET d’EZH2 qui sert au recrutement des DNMTs

Dans des cellules traitées par des ARNi ciblant EZH2, DNMT1, DNMT3a ou DNMT3b on observe une dérépression du gène MYT1. CONCLUSION: L’action conjointe de ces 4 protéines est nécessaire pour réprimer la transcription du gène MYT1.

Dans les cellules traitées par l’ARNi EZH2: - Perte de fixation des DNMTs CONCLUSION: EZH2 recrute les DMNTs Dans les cellules traitées par les ARNi DNMTs: - EZH2 est fixée et active (H3K27me3) - la fixation des autres DNMTs n’est pas affecté - La pol II est fixée - Le gène MYT1 est transcrit (Figure 6) CONCLUSION: EZH2 est nécessaire mais pas suffisante pour réprimer la transcription du gène MYT1 de manière stable

MYT1 MYT1 MYT1 MYT1 EZH2 EZH2 EZH2 H3 H3 H3 EZH2 EZH2 EZH2 DNMTs DNMTs DNMTs DNMTs K27me3 K27me3 K27me3 K27me3 K27me3 K27me3 K27me3 K27me3 K27me3 K27me3 K27me3 K27me3 H3 H3 H3 H3 H3 H3 H3 H3 H3 H3 H3 H3 H3 1- Fixation d’EZH2 en amont (-800/-2000), en aval (-200/+600) et au niveau (+1) du promoteur du gène MYT1. H3 EZH2 H3 H3 EZH2 2- EZH2 trimethyle les lysines 27 de l’histone H3 au niveau de ces même région PcG (Optionnel: la marque épigénétique H3K27me3 permet le recrutement du complexe répresseur PcG - > nécessaire mais pas suffisant! ) PcG 3- EZH2 recrute (via son domaine SET) les DNMTs 4- Les DNMTs méthylent l’ADN au niveau des îlots CpGs du gène MYT1 CH3 CH3 CH3 CH3 Le gène MYT1 est réprimé de façon stable

Correction du Contrôle continu 2007 Durée: 2 heures