1 / 73

БИОЕЛЕКТРОХЕМИЈСКА АНАЛИЗА ПОЛИАМИНО КИСЕЛИНА И ПРОТЕИНА

БИОЕЛЕКТРОХЕМИЈСКА АНАЛИЗА ПОЛИАМИНО КИСЕЛИНА И ПРОТЕИНА. др Марко Н Живановић *# * Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i . Department of Molecular and Cell Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Czech Republic

cato
Download Presentation

БИОЕЛЕКТРОХЕМИЈСКА АНАЛИЗА ПОЛИАМИНО КИСЕЛИНА И ПРОТЕИНА

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. БИОЕЛЕКТРОХЕМИЈСКА АНАЛИЗА ПОЛИАМИНО КИСЕЛИНА И ПРОТЕИНА др Марко Н Живановић*# *Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i. Department of Molecular and Cell Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Czech Republic #Институт за биологију и екологију, Природно-математички факултет, Универзитет у Крагујевцу Центар за преклиничка испитивања биоактивних супстанци, Крагујевац, Р. Србија

  2. Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула

  3. Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула • Одређивање протеина и угљених хидрата

  4. Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула • Одређивање протеина и угљених хидрата • Полилизин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди

  5. Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула • Одређивање протеина и угљених хидрата • Полилизин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди • Полилизин, полиаргинин и полихистидин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди

  6. Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула • Одређивање протеина и угљених хидрата • Полилизин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди • Полилизин, полиаргинин и полихистидин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди • Хистон H2A – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди

  7. Увод • Полиамино киселине (poly(aa)s) доприносе катализованој реакцији издвајања водоника на живиним електродама (CHER) дајући хронопотенциометријски (CPS) пик (peak H)или волтаметријски одговор • По први пут показана је специфична биоелектрохемијска улога сваке појединачне амино киселине у протеинима/пептидима • Базне poly(aa)s дајуpeak H, док киселе poly(aa)s (каоpolyGlu) не дају биоелектрохемијски сигнал • PolyLys се може посматрати као модел систем протеина хистона • PolyLys је коришћен за изучавање основних принципа важних у анализи интеракција ДНК са базним хистонима • Овај рад први је покушај изучавања хистона методама биоелектрохемије • peak H се може успешно користити у изучавању интеракције хистона и ДНК

  8. Увод 18. век – Luigi Galvani 20. век century – prof. J. Heyrovský, „De ViribusElectricitatis in Motu MusculariCommentarius“Чешки добитник Нобелове награде, 1959 „Father of electroanalytics“ – Polarography

  9. Увод Систем три електроде: - Радна електрода – HMDE (Hanging Mercury Drop Electrode) - Референтна електрода – Silver Chloride Electrode - Помоћна електрода – платина

  10. Увод Методе: • Циклична волтаметрија (CV)

  11. Увод Методе: • Циклична волтаметрија (CV) • Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV)

  12. Увод Методе: • Циклична волтаметрија (CV) • Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV) • „Square wave“волтаметрија (SWV)

  13. Увод Методе: • Циклична волтаметрија (CV) • Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV) • „Square wave“волтаметрија (SWV) • „AC“волтаметрија(ACV)

  14. Увод Методе: • Циклична волтаметрија (CV) • Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV) • „Square wave“волтаметрија (SWV) • „AC“волтаметрија(ACV) • Хронопотенциометријска стрипинг анализа при константној струји (CPSA)

  15. Увод Адсорпциони стрипинг, AdS • Анодни адсорпциони стрипинг

  16. Увод Адсорпциони стрипинг, AdS • Анодни адсорпциони стрипинг • Катодни адсорпциони стрипинг

  17. Увод Адсорпциони стрипинг (AdS) и Адсорпциони трансфер стрипинг(AdTS)

  18. Увод Адсорпциони стрипинг (AdS) и Адсорпциони трансфер стрипинг(AdTS) • E. Paleček – DNA studies

  19. Увод Адсорпциони стрипинг (AdS) и Адсорпциони трансфер стрипинг(AdTS) • E. Paleček – DNA studies • ex situмерења

  20. Увод Адсорпциони стрипинг (AdS) и Адсорпциони трансфер стрипинг(AdTS) • E. Paleček – DNA studies • ex situмерења • Потребно 3-10 µl раствора узорка

  21. CATALYTIC HYDROGEN EVOLUTION REACTION (CHER) Heyrovský, Brdička, Frumkin – Catalytic effect of organic bases on CHER at mercury Cat–H+ + e– [Cat–H] 2[Cat–H] H2 + Cat

  22. CATALYTIC HYDROGEN EVOLUTION REACTION (CHER)

  23. CHER – peak H Tomschik 1998 Heyrovský 1930 Brdička 1933 4 3 2 1 Поларографски сигнал HSA 1. Електролит 2. 400x разређен HSA presоdium wave 3. Co(III) редукција 4. Brdičkaкаталитичка реакција • Ad(T)S CPSA on HMDE • peak H • Редукциони процес

  24. CHER – peak H Presodim wave Tomschik 1998 Heyrovský 1930 Brdička 1933 4 3 2 1 Поларографски сигнал HSA 1. Електролит 2. 400x разређен HSA presоdium wave 3. Co(III) редукција 4. Brdičkaкаталитичка реакција • Ad(T)S CPSA on HMDE • peak H • Редукциони процес

  25. CHER – peak H Brdičkadouble wave Tomschik 1998 Heyrovský 1930 Brdička 1933 4 3 2 1 Поларографски сигнал HSA 1. Електролит 2. 400x разређен HSA presоdium wave 3. Co(III) редукција 4. Brdičkaкаталитичка реакција • Ad(T)S CPSA on HMDE • peak H • Редукциони процес

  26. CHER – peak H Порекло имена сигнала PEAK H

  27. CHER – peak H Порекло имена сигнала PEAK H • High sensitivity

  28. CHER – peak H Порекло имена сигнала PEAK H • High sensitivity • Hydrogen evolution

  29. CHER – peak H Порекло имена сигнала PEAK H • High sensitivity • Hydrogen evolution • Heyrovský

  30. CHER – peak H Предности • Аналогија са поларографским “presodium wave”, који је преблизу позадинског сигнала • peak Hје одлично одвојен од позадинског сигнала • Одређивање биомакромолекула у суб-наномоларним концентрацијама • Анализа структура биомакромолекула • Нативна форма vs. • денатурисана • агрегована • Wt vs. Mut • Оксидована/Редукована …

  31. CHER – peak H α-synuclein Предности

  32. CHER – peak H Предности

  33. CHER – peak H Предности

  34. Анализа полиамино киселина Poly(AA)s – Интермедијерни модел систем између једноставнијих пептида и комплексних протеина Базне poly(AA)s могу се сматрати модел системима базних хистонских протеина

  35. Амино киселине укључене у катализу

  36. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1 Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064.M21

  37. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1 • Прво испитивање poly(AA)s као модел система Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064.M21

  38. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1 • Прво испитивање poly(AA)s као модел система • Улога појединачних AA остатака у сигналу Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064.M21

  39. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1 • Прво испитивање poly(AA)s као модел система • Улога појединачних AA остатака у сигналу • Прво испитивање интеракције polyLys са ДНК Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064.M21

  40. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1 0.1 M McIlvaine пуфер, pH 6 PolyGlu, 22.2 µM PolyArg,Trp, 22.2 µM PolyLys, 22.2 µM Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064.M21

  41. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1 AdS CPSA/ HMDE 5.7 µM polyLys peak H Istr= −50 µA, tA=120 s; Ei=EA= − 0.1 V Background electrolyte: McIlvaine buffer, pH 6 Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064.M21

  42. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1 AdS CPSA/ HMDE polyLys peak H A) Istr= −40 µA, tA=120 s; Ei=EA= − 0.1 V 50 mM McIlvaine buffer, pH 6 B) 11.5 nM (1.5 ng/ml) polyLys Istr= −10 µA, tA=60 s; Ei=EA= − 0.1 V 100 mM McIlvaine buffer, pH 6 Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064.M21

  43. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1 AdTS CPSA/ HMDE polyLys/DNA interaction 1) 100 mM McIlvaine, pH 6 2) 5.7 µM polyLys 3) polyLys/DNA complex 5.7 µM polyLys/5 µM dsDNA Istr= −40 µA, tA=120 s; Ei=EA= −0.5 V Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064.M21

  44. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 2 Vargová, V., M. Zivanović, V. Dorčák, E. Paleček, and V. Ostatná, Catalysis of hydrogen evolution by polylysine, polyarginine and polyhistidine at mercury electrodes. ELECTROANALYSIS 2013. 25(9) p.2130 М21

  45. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 2 CPS peak Hје осетљив на амино киселински састав Vargová, V., M. Zivanović, V. Dorčák, E. Paleček, and V. Ostatná, Catalysis of hydrogen evolution by polylysine, polyarginine and polyhistidine at mercury electrodes. ELECTROANALYSIS 2013. 25(9) p.2130 М21

  46. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 2 CPS peak Hје осетљив на амино киселински састав CV такође показује значајан потенцијал у испитивању polyAA Vargová, V., M. Zivanović, V. Dorčák, E. Paleček, and V. Ostatná, Catalysis of hydrogen evolution by polylysine, polyarginine and polyhistidine at mercury electrodes. ELECTROANALYSIS 2013. 25(9) p.2130 М21

  47. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 2 CPS peak Hје осетљив на амино киселински састав CV такође показује значајан потенцијал у испитивању polyAA Базне poly(AA)s доприносе биоелектрохемијском сигналу CHER Vargová, V., M. Zivanović, V. Dorčák, E. Paleček, and V. Ostatná, Catalysis of hydrogen evolution by polylysine, polyarginine and polyhistidine at mercury electrodes. ELECTROANALYSIS 2013. 25(9) p.2130 М21

  48. Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 2 AdTS CV/HMDE AdTS CPSA/HMDE polyLys polyHis polyArg

  49. Биоелектрохемијско одређивање хистона H2A

  50. Биоелектрохемијско одређивање хистона H2A Људски геном садржи ~ 3x109парова база, чија укупна дужина износи преко 1 m Међутим, људски геном спакован је у нуклеусу пречника 10−5 m Боље разумевање структуре и функције хромозома и даље су у жижи научног интересовања Фокус даљег рада био је усмерен ка испитивању хистона и нуклеозома

More Related