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1. 南京农业大学 生命科学学院 生物化学技术原理及应用

2. 第四章 离心技术 离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颖粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的分离分析技术。

3. 第四章 离心技术 1 离心技术原理 2 离心机的构造与类型 3 离心的基本方法 4 离心机的使用 生命科学学院 生物科学51班

4. 第一节 离心技术原理 南京农业大学 生命科学学院 随着生物化学、分子生物学和生物工程的发展，离心分离技术已在科研和生产中广泛应用。每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种型式的离心机。 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小、密度和形状等。

5. 第一节 离心技术原理 • ω—粒子旋转的角速度 • r — 粒子的旋转半径 • Fc— 离心力 南京农业大学 生命科学学院 • 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义，即： Fc = m·G = m·r·ω2 = m·r·(2πN/60)2 • G — 粒子离心的加速度 • m — 沉降粒子的有效质量 • N — 转头每分钟转速(rpm)

6. 第一节 离心技术原理 南京农业大学 生命科学学院 1. 相对离心力（RCF） 由于转头有不同的制造商制造，半径不同，故用相对离心力来表示离心力的大小。 RCF (×g) = Fc/F重力 = mG/mg = r·ω2/g = 1.119×10-5·N2·r =11.2r(N/1000)2 也有： 根据这个公式，相对离心力（RCF）和每分钟转数（N）之间便可以互换，这种互换关系是很有实用价值的。

7. 第一节 离心技术原理 南京农业大学 生命科学学院 1. 相对离心力（RCF） 一般情况低速离心转速单位以rpm表示，高速离心则以重力加速度g表示。 在计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与中心轴之间的距离，即离心半径r（cm）的长度。离心管所处的位置不同，沉降颗粒所承受的离心力也不同。因此，超速离心常用重力加速度的倍数（g或×g）代替转速（rpm），这样可以真正反映颗粒在离心管中所受到的离心力。 离心力的数据通常是指相对离心力的平均值，也就是指离心管中点的离心力。离心机的转速、相对离心力和半径三者之间的换算关系见下页图。

8. 将离心机转数换算为相对离心力时， 首先，在 r标尺上取已知的半径和在 N 标尺上取已知的离心机转数。 然后，将这两点间划一条直线，在图中间 RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。 注意，若已知的转数值处于 N 标尺的右边，则应读取 RCF 标尺右边的数值；同样，转数值处于 N 标尺左边，则读取 RCF标尺左边的数值。 南京农业大学 生命科学学院

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10. 第一节 离心技术原理 G 南京农业大学 生命科学学院 2. 沉降速度v 离心时，一定条件下，颗粒在介质中受力平衡，匀速运动。 Ff = Fc − F b 与Ff = f v 经计算则有： 影响沉降速率的主要因素：颗粒直径d的大小；颗粒形状；颗粒与悬浮介质的密度差(ρp-ρm) ；一定温度下悬浮介质的黏度系数 μ ；离心加速度G。 在确定的条件下，沉降速率主要取决于离心机的转速。

11. 第一节 离心技术原理 南京农业大学 生命科学学院 3. 沉降系数S • 沉降系数，表示单位离心力场下的沉降速率，即通过单位离心力场所需的时间，因此单位为秒。 • r1-t1 ：离心前粒子离旋转轴的距离及时间 • r2-t2 ：离心后粒子离旋转轴的距离及时间 • S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。

12. 3. 沉降系数S • 沉降系数的作用： • 描述颗粒的大小。 • 预计沉降时间。对已知S值的物质，可预计在离心管中的沉降所需时间。 • 测定物质的分子量。根据Svedberg公式可计算出分子量 M = RTS20,w/D20,w(1-Vρ) • R--气体常数，等于1.987卡/度.摩尔 • S20,w— 标准状况下粒子的沉降系数 • D20,w— 理想状态时粒子的扩散系数 • V — 微分比容，等于溶质粒子密度的倒数 • ρ — 溶剂密度 • T — 热力学温度 南京农业大学 生命科学学院

13. 第二节 离心机的构造与类型 南京农业大学 生命科学学院 离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。

14. 第二节 离心机的构造与类型 • 低速离心机： • 组成：转头、电动机 • 转头带有放置离心管的孔 • 转头的中央位于离心机的驱动轴上 • 离心机的转速和温度控制不够准确 • 一般最高转速在6,000rpm以下 • 实验室中常用于分离制备。 • （详见本页备注） 南京农业大学 生命科学学院 根据转速的高低把离心机分为三种：低速离心机；高速离心机；超速离心机。

15. 高速离心机： • 组成较低速离心机增加温度控制系统（制冷系统） • 制冷设备温度控制在0-4℃范围内 • 实际速度和温度可通过仪表或指针显示 • 制动器 • 配有一定类型及规格的转头 • 最高转速在25,000rpm以下 • 常用于生物大分子的分离制备，如用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器（如核蛋白体）或单个分子。 • （详见本页备注） 南京农业大学 生命科学学院

16. 高速离心机： 南京农业大学 生命科学学院

17. 超速离心机： • 组成： • 驱动和速度控制 • 温度控制 • 真空系统 • 转头 • 增加真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。 • 常用于分离亚细胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白质分子。在分离时无须加入可能引起被分离物质结构改变的物质。 • （详见本页备注） 南京农业大学 生命科学学院

18. 第二节 离心机的构造与类型 南京农业大学 生命科学学院 • 据离心机的性能可分为：分析型，制备型和分析制备型。 • 制备用超速离心机主要用于生物大分子、细胞器和病毒等的分离纯化。 • 分析用超速离心机可用于样品纯度的检测、沉降系数和相对分子质最的测定。为此，分析用超速离心机一般都装有光学检测系统、自动记录仪和数据处理系统等。

19. 第二节 离心机的构造与类型 南京农业大学 生命科学学院 • 分析型离心机 • 分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程，从而确定其物理性质。（详见本页备注） • 主要特点就是： • 能在短时间内，用少量样品就可以得到一些重要信息， • 能够确定生物大分子是否存在，及其大致的含量， • 计算生物大分子的沉降系数，结合界面扩散估计分子大小， • 检测分子的不均一性及混合物中各组份的比例， • 测定生物大分子的分子量， • 还可以检测生物大分子的构象变化等。

20. 分析型超速离心机原理图 南京农业大学 生命科学学院

21. 分析型超速离心机原理图 南京农业大学 生命科学学院

22. 分析型离心机原理图 样品 溶剂 （对照） 南京农业大学 生命科学学院

23. 第二节 离心机的构造与类型 连续流转头 南京农业大学 生命科学学院 • 转头 • 制备型超速离心机所采用的转头种类繁多，转头可分为： • 角式转头 • 垂直转头 • 水平转头 • 区带转头 • 连续流动转头

24. 第二节 离心机的构造与类型 南京农业大学 生命科学学院 角式转头 离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度,角度变化在14-40°之间。

25. 角式转头 • 角式转头的特点： • 具有较大的容量，重心低，转速可较高，寿命较长。 • 样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管 的直径。 • “管壁效应” ：有一定的角度, 在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀, 此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。 • 在离心管的不同部位距旋转中心轴的距离也不同,那么在一定的转速下其RCF值也各不相同。 南京农业大学 生命科学学院

26. 第二节 离心机的构造与类型 南京农业大学 生命科学学院 • 水平转头 • 转头静止时,处在转头中的离心管中心线与旋转轴平行。 • 转头旋转加速时,离心管中心线由行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋转轴成90 °角。 • 粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本一致，有少量的“管壁效应” 。

27. 水平转头 • 转头水平转头的特点： • 转头的重心位置较高 • 样品粒子沉降穿过溶剂层的 距离大于直径 • 对多成分样品分离特别有效 • 常用于速率区带离心和等密度离心 • 优点是有利于离心后由管内分层取出已分离的各样品带。 • 缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。 南京农业大学 生命科学学院

28. 第二节 离心机的构造与类型 南京农业大学 生命科学学院 • 垂直转头： • 离心管垂直放置，样品颗粒沉降距离最短，离心所需时间短。适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作90°转向，因而降速要慢。 • 离心管垂直插入转头孔内，在离心过程中始终与旋转轴平行，而离心时液层发生角的变化，从开始的水平方向改成垂直方向，当转头降速时，垂直分布的液层又逐渐趋向水平，待旋转停止后，液面又完全恢复成水平方向。

29. 第二节 离心机的构造与类型 南京农业大学 生命科学学院 • 区带转头： • 区带转头无离心管，主要由一个转头桶和可旋开顶盖组成。 • 转头桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通过这些导管分布到转头四周，转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定。

30. 区带转头： • 区带转头特点： • 沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于角式和外摆式转头，在径向的散射离心力作用下，颗粒的沉降距离不变，因此区带转头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好 • 转速高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率的优点，使超离心用于制备和工业生产成为可能。 • 缺点是样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。 南京农业大学 生命科学学院

31. 第二节 离心机的构造与类型 南京农业大学 生命科学学院 • 连续流转头： • 用于连续流离心，可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转头桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转头桶壁，上清液由出口流出。 • 适用于稀溶液、大体积样液离心，可减少开机时间，提高效率。 • 也适用于在发酵工业化规模生产的细胞和培养液的分离，及不同生长周期细胞的分离。

32. 第二节 离心机的构造与类型 南京农业大学 生命科学学院 • 离心管 • 主要用塑料，不锈钢和特种玻璃 • 塑料离心管： • 优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。 • 缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 • 不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。 • 塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用： • 防止样品外泄。 • 防止样品挥发。 • 支持离心管，防止离心管变形。

33. 第三节 离心的基本方法 • 密度区带离心 • 速率区带离心 • 等密度区带离心 南京农业大学 生命科学学院 • 离心分离是制备生物样品广泛应用的重要手段。如分离活体生物、细胞器、生物大分子、小分子聚合物等。 • 对于生物样品的离心分离方法，主要是根据样品的不同来源和不同性质采取不同的离心方法。 • 目前常用离心方法有： • 沉淀离心 • 差速离心 • 连续流离心等 • 其它方法 • 连续流离心原理见连续流转头介绍

34. 第三节 离心的基本方法 • 根据颗粒大小来确定沉降所需要的离心力。 • 主要适宜于细菌等微生物、细胞和细胞器等生物材料，及病毒和染色体DNA等的离心分离。 • 沉降速度与离心力和颗粒大小有关，如右图： 南京农业大学 生命科学学院 1. 沉淀离心 • 沉淀离心技术是目前应用最广的一种离心方法。一般是指选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心力的作用下完全沉淀下来，这种离心方式称为沉降离心。

35. 第三节 离心的基本方法 南京农业大学 生命科学学院 2. 差速离心 • 差速离心法可以用来分离细胞，亚细胞结构或高分子。差速离心比较适用于差异比较明显的细胞或细胞器的分级分离，经过多次离心可以获得满意的效果。 • 原理： • 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 • 操作过程： • 一般是在离心后倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。

36. 2. 差速离心 • 差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。 • 优点：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 • 缺点：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒。沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。效率低，费时。 南京农业大学 生命科学学院

37. 差速离心法分离已破碎的细胞各组份 已破碎的细胞 500g,10分钟 沉淀 (细胞核) 上清液 10000g,10分钟 沉淀 (细胞膜碎片,线粒体,溶酶体) 上清液 100000g,3小时 上清液 (可溶性成份) 沉淀 (核糖核蛋白体) 南京农业大学 生命科学学院

38. 第三节 离心的基本方法 南京农业大学 生命科学学院 3. 密度梯度离心 • 密度梯度离心也称区带离心法。是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 • 其特点是离心管中液相介质密度是不均一的，自上而下密度逐渐增大，形成一定的梯度。 • 密度梯度离心技术有两种方法： • 速率区带离心 • 等密度梯度离心

39. 3. 密度梯度离心 • 经常使用的液相介质成分为甘油、蔗糖及某些盐类，如氯化钠、氯化艳溶液等。 • 优点：（详见备注） • 分离效果好，可一次获得较纯颗粒； • 适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒； • 颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 • 缺点： • 离心时间较长； • 需要制备惰性梯度介质溶液； • 操作严格，不易掌握。 南京农业大学 生命科学学院

40. 第三节 离心的基本方法 南京农业大学 生命科学学院 3.1 速率区带离心 • 速率区带离心法是根据大小不同、形状不同的颗粒在梯度液中沉降速度不同建立起来的分离方法。 • 离心前预先在离心管内装入密度梯度介质（如蔗糖、CsCl2），被分离物质的样品溶液位于梯度液的上面，在离心力的作用下样品中的各组分以不同的沉降速度沉降，当颗粒的沉降速度与某密度区域的浮力相等时，颗粒就停留在该密度区域内，使各组分达到分离的目的。 • 此法特别适宜于样品性质相近，而颗粒的直径和形状不同的组分分离，如后页图所示。

41. 3.1 速率区带离心 • 速欲获得满意的密度梯度离心效果，在密度梯度离心时必须注意两点： • 在制备梯度液时，必须考虑颗粒的质量密度必须大于任何位置的介质密度； • 必须控制好离心时间，要在所需样品到达管底之前停止离心。 • 可分离与介质密度相当的细胞、细胞器、DNA和蛋白质。沉降受物质本身大小的影响较大，一般应用在物质大小相异而密度相同的情况。 南京农业大学 生命科学学院

42. 第三节 离心的基本方法 • 自身的密度相同的溶剂梯度中为止，其结果是依样品物质密度的不同在梯度溶剂中形成一个个区带。 • 特点：沉降分离与样品物质的大小和形状无关，而取决于样品物质的密度。转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。 南京农业大学 生命科学学院 3.2 等密度梯度离心 • 等密度离心法也叫沉降平衡法。所谓等密度是指样品密度与介质的密度相等，实际上是在梯度密度介质中进行的。 • 在离心时，颗粒依其密度的不同沉降或向上漂浮，直到移动到与

43. 3.2 等密度梯度离心 • 等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。 • 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CsCl，其密度可达1.7 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。 • 注意点： • 离心时间要长 • 粒子密度不宜太近 • 可用角式转头或水平式转头 • 不能用刹车 • 密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 南京农业大学 生命科学学院

44. 第三节 离心的基本方法 南京农业大学 生命科学学院 3. 密度梯度离心 • 梯度材料的选择原则： • 与被分离的生物材料不发生反应。 • 可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度pH变化较小。 • 不会对离心设备发生腐蚀作用。 • 容易纯化，价格便宜或容易回收。 • 浓度便于测定，如具有折光率。 • 对于分析超速离心工作来说，它的物理性质，热力学性质应该是已知的。

45. 各种粒子的密度；等密度梯度离心介质密度大于样品各种粒子的密度。 • 时间效应不同：速率区带离心不能长时间离心；等密度梯度离心长时间离心将各种粒子停留在等密度位置形成区带。 南京农业大学 生命科学学院 3. 密度梯度离心 • 两种密度梯度离心的区别： • 依据的原理不同：速率区带离心依据粒子的沉降速率被分离；等密度梯度离心依据粒子本身的密度差异被分离。 • 介质的梯度范围不同：速率区带离心介质的密度小于样品中

46. 穿刺法 • ）。当取代液不断注入时离心管中的溶液逐渐上升，并不断从收集导管中流出，然后用部分收集器分别收集。 南京农业大学 生命科学学院 3. 密度梯度离心 • 离心后样品的收集： • 无论是采用哪种操作方式，最终都要分别收集处在每一区带的样品组分，一般可采用下述两种方法实现： • 穿刺法：用一根金属空心针从离心管底刺人管内，不同区带内的组分自下而上地先后从针管内分别流出，然后用部分收集器分别收集。 • 取代法：往离心管中注入高密度的离心介质（其密度高于离心管中所形成的最大密度

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48. 第四节 离心机的使用 南京农业大学 生命科学学院 • 高速与超速离心机因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程： • 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各离心机说明书所规定的范围。 • 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。 • 每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护。

49. 南京农业大学 生命科学学院 • 若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。 • 离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常声音应立即停机检查，及时排除故障。 • 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时。 • 离心时不准开盖，不准用手停止转头。

50. Thank You !