Кинетика биолюминесцентной реакции, катализируемой бактериальной люциферазой

1. Сибирский федеральный университет Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Кафедра биофизики Отчет о Научно-исследовательской работе: Кинетика биолюминесцентной реакции, катализируемой бактериальной люциферазой • Магистрант 2-го года: • Авсиевич Татьяна Игоревна • Научный руководитель: • к. ф.-м. н., доцент кафедры биофизики ИФБиБТ • Немцева Елена Владимировна

2. Фундаментальная проблема • Структурно-динамическая организация белков • Принципы функционирования ферментов in vivo Практическая значимость • Остаются открытыми вопросы: • Характер взаимодействия реагентов • Формированиие возбужденного комплекса • Влияния модифицированных сред на биолюминесцентную реакцию 2

3. Современное состояние проблемы ? Экспериментальные данные «биферментная система+фактор» Математическая модель моноферментной реакции (Межевикин, 2011) Анализ экспериментальных данных с помощью мат. модели позволит: Определить на какие этапы биолюминесцентной реакции влияет вязкость среды; Проследить за изменением активности бактериальной люциферазы с увеличением вязкости среды; Определить тип воздействия вязких сред на биолюминесцентную реакцию.

4. Цель и задачи магистерской диссертации Цель: Выяснить механизм воздействия вязких сред на кинетику моноферментнойбиолюминесцентной реакции. • Задачи: • Зарегистрировать нестационарную кинетику биолюминесцентной реакции бактерий методом остановленной струи; • Проанализировать закономерности влияния вязких сред на кинетику реакции; • Проанализировать экспериментальные данные с помощью математической модели; • Выявить стадии реакции, наиболее подверженные влиянию вязких сред. 4

5. Цель и задачи практики Цель: Освоить методику регистрации нестационарной кинетики биолюминесцентной реакции бактерий методом остановленной струи • Задачи: • Освоить методику работы на анализаторе кинетики быстрых процессов SFM-300/400 (BioLogic); • Адаптировать методику фотовосстановления флавинмононуклеотида для применения на анализаторе кинетики быстрых процессов; • Отработать методику регистрации нестационарной кинетики биолюминесцентной реакции бактерий методом остановленной струи. Практика была пройдена в Институте экспериментальной физики IV университета г. Байройт (Германия) при поддержке гранта ККФНиНТД. 5

6. Объект исследования Биолюминесцентная реакция бактерий Быстрое окисление субстрата(проблема!): 1) Нестационарная кинетика 2) Многосубстратная 3) Многостадийная Схема 2 RibP = CH2(CHOH)3CH2OP(O)(OH)2 J. W. Hastings, Q. H. Gibson, 1963

7. Результаты: фотовосстановление ФМН Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) - стабилизатор

8. Результаты: фотовосстановление ФМН Разработанная методика • Приготовление фотовосстановленного дегазированного раствора ФМН в буфере (в шприце для анализатора кинетики): • Вакуумная дегазация с применением ультразвуковой ванны Sonorex (BANDELIN); • Барботирование аргоном в течение 15 минут; • Наполнение шприца раствором с аргоновой «подушкой» сверху; • Облучение реагента в шприце светом ксеноновой лампы. Таблица 1. Состав реакционной смеси для фотовосстановления ФМН Sonorex (BANDELIN)

9. Результаты: фотовосстановление ФМН Контроль восстановления на спектрофотометре: Спектр поглощения восстановленного и окисленного ФМН Окисленный ФМН A445 = 0,56 Восстановленный ФМН A445 = 0,11

10. Кинетика окисления ФМН, снятая наStopped-Flow SFM 300 (режим абсорбции) • Кинетика окисления ФМН при смешивании: 1 - с буфером 2 – с дегазированным буфером

11. Кинетика окисления ФМН при смешивании с буфером, снятая наStopped-Flow SFM 300 (режим флуоресценции) • Excitation wavelength : 445 nm • Emission wavelength : 0 nm • HV= 609V • Total volume : 150 µl Flow : 12 mL/s • Dead time : 2 ms

12. Результаты: освоение анализатора Анализатор кинетики быстрых процессов Stopped-Flow SFM 300 • Одновременное смешивание 3-х реагентов • Минимальное мертвое время для микрокюветы 0.25ms

13. Результаты: освоение анализатора Оптическая ячейка TC-100/10F • Мертвый объем 30,2 L • Мертвое время 3 ms

14. Результаты: регистрация кинетики Методика регистрации биолюминесцентной вспышки Stopped-Flow SFM 300 Таблица 2. Реакционная смесь для каждого шприца

15. Результаты: регистрация кинетики Алгоритм регистрации кинетики биолюминесценции: • Заполнение экспериментальной установки азотом; • Установить 0 для значений длин волн возбуждения и испускания; • Включить напряжение ФЭУ: HV=600 V; • Задать объем в зависимости от отношения смешиваемых объемов из каждого шприца; • Мертвое время оценивается в зависимости от скорости потока и смешиваемого объема. • Excitation wavelength : 0 nm • Emission wavelength : 0 nm • HV= 609V • Total volume : 150 µl Flow : 12 mL/s • Ratio : S1: 1, S2: 1, S3: 1 • Dead time : 2 ms

16. Результаты: регистрация кинетики Варьирование концентрации альдегида Подбор адекватной концентрации альдегида для протекания биолюминесцентной реакции

17. Результаты: регистрация кинетики

18. Выводы • Для получения кинетической кривой реакции, катализируемоуй бактериальной люциферазой, необходимо создание условий, приближенных к анаэробным: дегазация растворов ФМН, наполнение установки азотом и др. • Экспериментальные условия с «мертвым» временем около 2 ms позволяют регистрировать полную кинетическую кривую биолюминесцентной реакции, включающую не только спад, но и начальный рост светоиспускания; • Требуются дополнительные меры по гомогенизации раствора альдегида (не только с точки зрения контроля концентрации, но и для корректной работы установки). • Для более полного отображения механизма действия люциферазы требуется проведение эксперимента с введением вязких сред.