第六章 体外分析

1. 第六章 体外分析 重庆医科大学 彭志平 哈尔滨医科大学第一医院 杨志杰

2. 【目的要求】 • 了解体外分析技术的定义、种类、发展和共同特点。 • 了解放射免疫分析技术的发展； • 掌握放射免疫分析的原理、未知样品的测量。 • 了解放射免疫分析技术的试剂要求；掌握放免技术的分类方法。 • 了解放免分析质量控制的分类、目的；质量控制的指标及意义。 • 了解免疫放射分析的原理；掌握免疫放射分析的方法及与放射免疫分析的异同；了解免疫放射分析的特点 【教学内容】 体外分析技术 定义、分类、发展和共同特点。 放射免疫分析 建立和发展；在临床中的地位 原理：标准曲线、未知样品的测量 各试剂的要求和配制；分离方法的要求、种类 放射免疫分析的质量控制：目的、分类、指标和意义 免疫放射分析 原理、方法 与放射免疫分析法的异同 免疫放射分析的特点及临床应用

3. 定义 • 以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。

4. 放射分析方法或其派生的相关技术。 • 在体外进行机体内物质种类和含量的分析测定。 • 测定对象是患者血清或其他体液样品内的激素、其它生物活性物质和药物浓度等。

5. 发展 • 1956年Berson和他的同事们偶然地观察到131I标记的胰岛素与胰岛素抗体的结合与体系中存在的非标记胰岛素的量呈一定的相关关系，而建立了放射免疫分析法 ，对医学的发展起到了划时代的推动作用，于1977年获得诺贝尔医学奖 。 • 几乎是在同一时期，Ekins和Murphy建立了竞争性蛋白结合分析方法，测定甲状腺素（T4）和皮质激素。

6. 商品化试剂盒的应用。 • 多种体外分析技术的互相渗透。例如将酶免疫分析技术与荧光技术或化学发光技术结合，建立的荧光酶免疫分析及化学发光酶免疫分析，可极大地提高灵敏度，增大检测范围。 • 检测自动化。 • 实现多个待测物同时检测，如时间分辨荧光免疫分析。

7. 使体外分析技术在临床和基础医学研究上应用极为广泛。使体外分析技术在临床和基础医学研究上应用极为广泛。 • 如内分泌学、肿瘤学、免疫学、病毒学、药理学、血液学、消化病学、神经病学、妇产科学等被推广应用，有力地推动了医学科学的发展。

8. 体外分析技术建立的基础: • 以配体和结合体的特异性结合反应为共同的生物学基础 • 以结合反应动力学规律作为共同的方法学基础 • 以放射性等的测量技术作为共同的定量手段

9. 生物学基础：特异性结合反应 • 配体-结合体 抗原-抗体的免疫结合反应； 配基-受体的结合反应； 底物-催化酶之间的酶促反应； 　　 激素-激素结合球蛋白的结合反应。

10. 方法学基础：结合反应动力学规律 • 遵守可逆反应的质量作用定律： k1, v1 [L]+[R] [RL] k2, v2

11. 定量手段(标记配体作为示踪剂) • 放射性测量技术 • 酶定量技术 • 化学发光定量技术 • 荧光定量技术

12. 发展 • 1956年Berson和他的同事们偶然地观察到131I标记的胰岛素与胰岛素抗体的结合与体系中存在的非标记胰岛素的量呈一定的相关关系，而建立了放射免疫分析法，对医学的发展起到了划时代的推动作用，于1977年获得诺贝尔医学奖。 • 几乎是在同一时期，Ekins和Murphy用自然存在在血液里的激素结合球蛋白（hormone-binding globulins）建立了竞争性蛋白结合分析方法(competitive protein binding assays, CPBA)，测定甲状腺素(T4)和皮质激素。

13. 近年来的主要优势包括多种技术的互相渗透，自动化程度的提高等。例如将酶免疫分析技术与荧光技术或化学发光技术结合，建立的荧光酶免疫分析及化学发光酶免疫分析，可极大地提高灵敏度，增大检测范围。近年来的主要优势包括多种技术的互相渗透，自动化程度的提高等。例如将酶免疫分析技术与荧光技术或化学发光技术结合，建立的荧光酶免疫分析及化学发光酶免疫分析，可极大地提高灵敏度，增大检测范围。 • 在时间分辨荧光免疫分析( TRFIA)等分析法中应用新技术实现多个待测物同时检测。

14. 分类: 放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA) 放射性竞争结合分析 体外放射分析 体外分析技术 放射性非竞争结合分析 免疫放射分析 (immunoradiometric assay,IRMA) 酶免疫分析 (EIA) 化学发光免疫分析 体外非放射分析 (CLIA) 荧光免疫分析 (FIA)

15. 放射免疫分析radioimmunoassay, RIA

16. 放射免疫分析法是Yalow和Berson于1960年在研究胰岛素的时候创立的一种体外放射分析技术。放射免疫分析法是Yalow和Berson于1960年在研究胰岛素的时候创立的一种体外放射分析技术。 • 结合了放射性核素的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性。 Dr. Yalow

17. 一、RIA的基本原理 （一）竞争抑制结合反应： 放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原（*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞争抑制结合反应。

18. 基本原理 • *Ag与Ag免疫活性相同 • *Ag＋Ag >Ab *Ag-Ab +*Ag *Ag Ab + (F) (B) + Ag-Ab + Ag Ag Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)

19. + + + Ag *Ag Ag *AgAb AgAb + + *Ag Ab + + + + + + + + + + + + + + + +

20. （二）剂量反应曲线：标准曲线 • 标记物与被测物之间的函数关系可以用剂量反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准曲线。 • 标准抗原(标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知剂量的非标记抗原。

21. 标准曲线的绘制方法 • 用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应； • 在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F； • 分别测量B和F的放射性； • 用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是剂量反应曲线。

22. B3% B4% B1% B2% B5% B6% Ab 分离B、F *Ag B%=B/(B+F) F%=F/(B+F) R=B/F Ag 1 2 3 4 5 6 50 100 25 200 800 浓度 400

23. B% 标 准 曲 线

24. 未知样品的测量 • 在同等条件下，用待测抗原与一定量的标记抗原与限量特异性抗体发生反应，并用同样的方法分离待测抗原的B和F，测量其放射性，计算出B/F，在剂量反应曲线上就可以查出对应的抗原浓度。

25. B3% B4% B1% B2% B5% B6% B% Ab 分离B、F *Ag Ag 1 2 3 4 5 6 ？ 50 100 25 200 800 400

26. F% B% B/F 60 Calibration Curve

27. 在实际的操作中，一般要设立： • 最大结合管（Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。 • 非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。

28. 总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总放射性。总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总放射性。 • 标准管（B1~Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为B。 • 样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。

29. 选用不同的反应变量作纵坐标，标准曲线的形状也不同。选用不同的反应变量作纵坐标，标准曲线的形状也不同。 常用的有B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B等。

30. 标准曲线左：横座标为等份刻度；右：横座标为对数刻度标准曲线左：横座标为等份刻度；右：横座标为对数刻度

31. 二、RIA基本试剂 （一）抗原： • 指能够在一定条件下刺激机体产生相应的抗体，并能与其抗体在体内、外发生特异性结合的物质。 • 抗原上的抗原决定簇是决定并控制免疫反应特异性的关键部位。

32. 抗原的作用： • 作为免疫原免疫动物，制备特异性抗体。 • 制备标准抗原，绘制标准曲线。 • 制备标记抗原。

33. 1.标准抗原 • 是厂家给出已知剂量的非标记抗原。 • 一般每一个RIA试剂盒里都有浓度由小到大的多瓶标准抗原。

34. 标准抗原的要求： • 标准抗原与待测抗原、标记抗原具有基本相同的免疫活性，即质同。 • 他们的化学结构和化学性质要相同，对特异性抗体的亲和力要相同。并且，标准抗原与待测抗原所处的介质条件要相同。

35. 标准抗原的定量要准确： • 整个RIA分析系统的定量基础就是标准抗原的量，因此标准抗原的定量一定要准确，即与国家规定的标准品相比有良好的可比性。 • 只有保证标准抗原的准确定量，才能保证RIA分析系统的准确度和精确度。

36. 标准抗原必须高纯度： • 标准抗原应该含有尽可能少的化学杂质，以避免杂质对反应和计量的影响。 • 标准抗原的稳定性要好： • 要保证在试剂盒的运输、储存和在实验过程中应该不发生降解，分离、破坏等。

37. 2.标记抗原： • 指抗原分子中有一个或两个原子被放射性核素所取代。 • 常用的标记的放射性核素有3H，125I等。 • 最常用的是125I，因为他的比活度比较高，标记和测量都相对容易，且半衰期合适（60天）利于商品化。

38. 标记抗原的要求 • 质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质和免疫活性要相同。 • 标记抗原要有适当高的放射性比活度。 • 比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。 • 但过高的比活度，也会引起诸如辐射自分解和免疫活性受损的问题。

39. 标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大于95%。标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大于95%。 • 放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对RIA的免疫反应和动力学参数产生影响。 • 由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗原一般要经过重新提纯后才能再次使用。

40. 标记抗原的稳定性要好： • 和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素射线的影响，更容易发生分解。 • 在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。

41. (二)特异性抗体 • 包括多克隆抗体和单克隆抗体。 • 抗体的质量之间关系到RIA分析方法的灵敏度和特异性。

42. 多克隆抗体一般是用抗原免疫年轻、健康的纯种小动物（一般是羊或兔子）而诱发产生的抗血清。制备的方法成熟、简便、生产量大；但是里面成份复杂，免疫反应的动力学规律复杂。多克隆抗体一般是用抗原免疫年轻、健康的纯种小动物（一般是羊或兔子）而诱发产生的抗血清。制备的方法成熟、简便、生产量大；但是里面成份复杂，免疫反应的动力学规律复杂。 • 单克隆抗体是通过杂交瘤技术筛选制备的，成份单一、稳定、特异性强；但成本较高。

43. 抗体的要求（三高） 高亲和力 高特异性 高滴度

44. 抗体的检测指标 1. 亲和常数K（affinity constant）： • 亲和常数反应了抗体与抗原的亲和力。 • K值越大，形成抗体抗原复合物速度快，解离少，灵敏度高，准确度和精确度都好。 • K=结合常数k1 / 解离常数k2。

45. 2. 交叉反应率： • 指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的特异性。 • 在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似的类似物，例如甲状腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。 • 交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。

46. 常用50%置换法来测定交叉反应的百分率。 • 即将被测物质和其类似物，分别作竞争抑制曲线，比较两者在其结合率为零管结合率（B/B0=50%）时的剂量响应浓度，其比值即为交叉反应百分率，也就是该抗体对被测物某种类似物的相应活力。

47. 3. 滴度： • 又称稀释度，反映了抗血清中有效抗体的浓度。 • 指在没有标准抗原存在的时候，结合50%的标记抗原时抗血清的稀释度。 • 其方法就是用缓冲液将抗血清稀释为不同的浓度，各置于试管中，然后各加一定量的标记抗原进行反应，等到反应平衡后分离B和F，测出B的放射性，算出B%，以B%为纵坐标以抗血清的稀释度为横坐标作出抗血清稀释曲线，B%为50% 所对应的抗血清滴度为工作滴度。

48. (三)待测样品 • 一般是人的血液制品如血浆、血清等，也可以是人的体液或组织液。 • 要求样品的制备应符合放射性检测方法的要求，并去除样品中可能存在的干扰成份。

49. 三、RIA的分离方法 • 指分离标记抗原抗体复合物（B）和游离标记抗原（F）的方法。 • 根据使用的分离剂不同可以分为： • 非特异性分离方法：利用物理、化学或生物化学的方法如吸附、过滤、沉淀等。 • 特异性分离方法：利用免疫反应的特异性来进行分离的方法如双抗体法等。

50. （一）分离方法的要求 • 分离完全、快速。 • 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 • 受环境因素（温度、PH值等）的影响小。 • 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。