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Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology Microbiology 第 四章 Microbiology 微 生 物 的 生 长 及 其 控 制
内容提要 测定微生物生长繁殖的方法 微生物的生长规律 影响微生物生长的主要环境因素 微生物培养法概论 有害微生物的控制 Microbiology
第一节 测定微生物生长繁殖的方法 生长：个体体积的增大及细胞原生质量的增加。 繁殖：个体数量的增多。
测定生长繁殖的方法 测定生长繁殖的方法 微生物的纯培养 测生长量 计繁殖数 Microbiology
一、纯培养的分离方法 固体培养基分离纯培养 稀释倒平板法 涂布平板法 平板划线法 稀释摇管法 液体固体培养基分离纯培养 液体稀释分离法 单细胞挑取法 选择培养基分离法
Viable cell count 1 ml 1.dilute sample 9 ml 10 100 1000 104 105 106 107 cell no/ml 2. plate out 0.1 ml
Mixed culture Swab from sole of shoe Oral swab 口腔试样 鞋底试样
Mixed culture Pure culture
高氏培养基 土豆培养基 牛肉膏培养基 选择培养基分离法 1 ml 1.dilute sample 9 ml 10 100 1000 104 105 106 107
生长测定的指标 单细胞微生物 细胞数 细胞质量、体积 多细胞微生物 菌丝重量 菌丝生长长度 测定方法 直接计数法 显微技数法 比例计数法 比色法 间接计数法 测定菌落数、或细胞物质等。 二.微生物生长的测定
（一）测生长量法 1、直接法 测体积法 测干重法
2、间接法 （1）比浊法 （2）生理指标法 • 含氮量：蛋白质总量=含氮量×6.25 细胞总量=蛋白质总量÷65%=蛋白质总量×1.54 • RNA/DNA法：8.4×10－5ng/细胞 • 叶绿素法 • P、ATP、酶活性、产酸、产气、产热、某一营养物质的消耗量或某一产物的形成量等
电子自动计数法 • 电子计数器法 Coulter电子计数器：可测定细胞数、细胞大小分布。 • 比浊法： 原生质含量的增加，会引起培养物浑浊度的增高。 注意： 普通电子自动计数器
（二）计繁殖数 1、直接法——显微计数法 各种计数板 2、间接法——活菌计数法 平板菌落计数法：倾注法、涂布法 液体稀释法（或然率法） 薄膜过滤计数法 厌氧菌的菌落计数法：亨盖特滚管培养法
1、显微计数法 在显微镜下直接计细胞数 • 酵母和霉菌的孢子： 用Thoma血球计数板，在显微镜高倍镜下直接计数。 • 细菌： 用Petriff-Hausser计数器或Helber计数器，Petroff-Hausser计数小室的玻璃要薄一些，以便于进行暗视野照明，体积为0.02mm3。
2、间接计数法 • 平板菌落计数法 适用：单细胞或单孢子菌悬液 方法：稀释分离， 倾注平板、涂布平板 • 薄膜过滤计数法 微孔滤膜如硝化纤维素薄膜 适用： 量大、含菌浓度低的样品
液体稀释法（或然率法） 将样品作10倍系列稀释，接种液体试管，培养后记录出现生长的试管数，查表并计算。 例：某一细菌在稀释法中的 生长情况如下 稀释度 -4 -5 -6 -7 -8 重复数 5 5 5 5 5 生长管数 5 5 4 1 0 数量指标“541”，查统计分配表17 原菌液中的活菌数=1.7×10 个/毫升 6
（三）其他方法 霉菌菌丝长度的测定 • 菌落直径测定法： • U型管测定法：
第二节 微生物的生长规律 • 细胞生长的标志：外观上是细胞由小长大 • 包括： 染色体（或DNA）的复制、 核糖体的生物合成、 线粒体的生物合成、 细胞壁的生物合成等
微生物的生长规律 • 同步生长 • 单细胞微生物的典型生长曲线 • 微生物的连续培养 • 微生物的高密度培养
一、同步培养(synchronous culture) 使培养基中细菌同时分裂，处于相同的生长阶段（处于分裂步调一致的生长状态）叫同步生长。 获得同步生长(synchronous growth)的方法： 诱导法 过滤法 选择法 （体积大小相同） 离心法 抑制ＤＮＡ合成法 Microbiology
能使群体中生长不同步的细胞转变为能同时进行生长或分裂的群体细胞的培养方法。（使培养基中细菌同时分裂，处于相同的生长阶段（处于分裂步调一致的生长状态）叫同步生长。 ） 同步培养方法 机械方法 环境条件控制法 其它方法 一.同步培养 synchronous culture
机械法 离心方法 过滤分离法 硝酸纤维素滤膜法 • 优点： 不打乱细胞原有的代谢。 • 缺点：
温度调节法 培养基成分控制 控制限制因子的量 或添加某些抑制剂（氯霉素抑制菌体蛋白合成） 其它方法 用交替见光和黑暗处理光合细菌 优点： 缺点： 打乱细胞原有的正常代谢。 环境条件控制法
二.微生物群体生长规律 • 群体生长：包含了个体生长和繁殖 • 微生物生长的表示 通常以细胞重量或细胞数倍增所需要的时间为表征
分批培养（单批培养，密闭培养） 曲线的测定：液体 将少量细菌接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细胞密度，以活细胞数的对数对培养时间所作出的曲线称为生长曲线。 微生物的典型生长曲线：延滞期、指数期、稳定期、衰亡期 微生物的非典型生长曲线：延滞期、快速生长期、生长衰退期 （一）细菌生长曲线的测定
据生长速率常数（每小时分裂次数R）把典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期、衰亡期据生长速率常数（每小时分裂次数R）把典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期、衰亡期
细胞生理特点： 分裂迟缓、菌体大、DNA含量高代谢活跃 出现的原因： 为了调整代谢（需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物） 影响因素： 菌种的遗传性、菌龄、接种量、及移种前后所处的环境条件等。 缩短意义：可以缩短生产周期，提高设备利用率。 缩短措施： 增加接种量 调整营养成分 采用对数期的种子接种 选用繁殖快的菌种 1.延滞期（lag phase 调整期、适应期、停滞期）
延滞期出现原因 把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为０，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代 谢产物，要经过一个调整和适应过程 。 Microbiology
细胞数呈几何级数增加 细胞的生理特点： 细胞生长速率R最大， 均衡生长：个体形态、化学组成和生理特性等均一致， 代时（G，世代时间，增代时间）或倍增时间：最短 酶系活跃，代谢旺盛 出现原因：细胞完成生理调整，基质营养和环境适宜 代谢生理等研究材料，增殖酵母菌的最适材料，作为发酵的种子可缩短延迟期。 2.对数期 （log phase，指数期）
繁殖代数和世代时间 lgXt－lg X0 lg2 • n= • G= • R= 3.322(lgx2-lgx1) t2 - t1 • n：繁殖代数 • G：世代时间 • R：生长速率常数 • X0 ：在对数期第一次取样时的细胞密度个/ml • Xt：在对数期第二次取样时的细胞密度个/ml • t ： 两次取样的时间间隔（分） t lg2 lgXt－lgX0
影响指数期代时长短的因素 • 菌种 • 营养成分 • 营养物浓度： 低浓度（0.1~2.0mg/ml）影响菌体产量、R 提高浓度（2.0~8.0mg/ml）影响菌体产量 进一步提高不影响菌体产量、R 生长限制因子：凡处于低浓度范围内可影响菌体产量、R的某营养物 • 培养温度
细胞数变化： 活细胞数保持动态平衡（正生长和负生长相等），总细胞数开始时仍呈上升趋势。 菌体产量与营养物质的消耗间呈有规律的比例关系（生长产量常数Y，或称生长得率）： Y= x - x0 C0 - C 还有更精确的计算方法。 出现原因：营养尤其生长限制因子的消耗，营养物比例失调，有害代谢产物积累， PH值EH值等理化条件不适 3.平衡期 （stationary phase，最高生长期，稳定期）
细胞生理特点： 分裂速度降低 活细胞数达到最大值 开始积累储藏物质 积累发酵产物（次生代谢物，对数期-菌体生长期，稳定期-代谢产物合成期） 芽孢细菌产生芽孢* • 实践意义：生产收获时期（菌体及相平行的代谢产物）；细胞物质生物测定；促进连续培养原理提出和工艺技术创建
细胞数变化： 活细胞数逐渐下降 细胞生理特点： 细胞内颗粒更加明显,出现液泡 细胞出现异常形态 细胞死亡伴随自溶 产生原因：遗传，培养条件和环境不适宜 细菌生长曲线的用途： 研究上 生产上 4.衰亡期 decline phase
（二）真菌的生长曲线 1.酵母菌的生长曲线： 与细菌相似 2.丝状真菌的生长曲线 三个时期 各期特征 生长停滞期 孢子萌发前的时期 迅速生长期 菌丝伸长及分枝 衰退期 菌丝体干重下降 伴随自溶
三.微生物的培养方法 1.分批培养 batch culture 将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方法。 • 摇瓶培养
连续培养 在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物，使微生物的增殖速度及培养基中的总菌量保持不变的培养方法。（长期保持在指数期的平衡生长状态和恒定的生长速率） 连续培养用于生产实践就称连续发酵. 一个重要特征： 是使微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养的方法：按控制方式分： 恒浊器法：内控制 恒化器法：外控制（控制流速和R） 控制器种类很多：串联级数、细胞状态、用途 2.连续培养continuous culture
