梅毒螺旋体血清学检测（间接凝集法）

梅毒螺旋体血清学检测（间接凝集法）

凝集反应 • 是指颗粒性抗原，例如细菌、红细胞、螺旋体、细胞性抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，与相应的抗体（或抗原）在适量的电解质存在的条件下，经一定时间后凝聚成肉眼可见的凝集现象。 • 凝集反应是经典的血清学反应，使用历史悠久并一直沿用至今。 • 1896年， Widal——诊断伤寒病； • 1900年，Landsteriner——发现人类ABO血型

凝集反应 • · 反应阶段： • 抗原抗体的特异性结合 • 出现肉眼可见的凝集现象 • · 反应特点： • IgM的作用比IgG大数百倍 • IgG与抗原结合后，常不出现凝集反应，称不完全抗体

凝集反应分类 根据凝集反应中抗原的性质，反应的方式分为：

特殊类型： • 自身红细胞凝集反应试验 • 抗球蛋白参与的凝集试验

直接凝集反应（direct agglutination） 细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。参加反应的颗粒性抗原称为凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin）。

玻片法：（定性） • 细菌鉴定 • ABO血型的鉴定试管法：（半定量） • 肥达试验（Widal test）---伤寒 • 外斐试验（Weil-Felix test）---立克次体 • 交叉配血试验

间接凝集反应（indirect agglutination） 将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联与免疫无关、大小适当的颗粒性载体的表面，使之成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应（indirect agglutination）或被动凝集反应（passive agglutination）。其敏感度高于直接凝集反应和沉淀反应。

常用载体： • RBC • 聚苯乙烯胶乳（polystyrene latex） • 明胶颗粒 • 活性炭 • 皂土（bentonite） • 火棉胶

间接凝集反应的类型 分类依据： • 根据致敏载体用的是抗原（正向）或抗体（反向） • 根据载体（RBC、胶乳、明胶） • 根据凝集反应的方式（间接凝集试验、间接凝集抑制试验、协同凝集试验）

1.（正向）间接凝集试验用抗原致敏载体--检测抗体1.（正向）间接凝集试验用抗原致敏载体--检测抗体

2.反向间接凝集试验用抗体致敏载体--检测抗原2.反向间接凝集试验用抗体致敏载体--检测抗原

3.间接凝集抑制试验用抗原致敏载体--检测抗原3.间接凝集抑制试验用抗原致敏载体--检测抗原

4.协同凝集试验（coagglutination） • 原理同反向间接凝集反应 • 金黄色葡萄球菌菌体细胞壁中含有A蛋白（staphylococcus protein A，SPA），SPA具有能与特异性抗体IgG的Fc段结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体。

5.间接血凝试验（indirect hemagglutination test）

血凝试验强度

6. 胶乳凝集试验 • 聚苯乙烯胶乳微粒作为载体（羟化聚苯乙烯胶乳） • 敏感性不及RBC试验 7. 明胶凝集试验 • 载体为明胶颗粒

间接凝集反应的应用 快速、敏感、操作简便、无需特殊设备 • 抗体的检测 • 细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体 • 自身免疫性疾病的抗体检测 • 超敏反应患者的抗体测定 • 抗原的检测 • AFP • HBsAg • HCG

自身红细胞凝集试验（autologous red cell agglutination assay） • 红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。 • 试剂：抗人O型红细胞的单克隆抗体（这种抗体能与不论何种血型的红细胞结合，但不引起凝集反应。） • 临床应用：HIV检测、HBV检测

抗球蛋白试验 • 1945年Coombs建立，又称Coombs试验 • 检测抗红细胞不完全抗体的一种很有用的方法。 • 利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，使红细胞凝集。

直接Coombs试验（Direct Coombs test） 检测RBC上的不完全抗体

间接Coombs试验（Indirect Coombs test） 检测游离在血清中的不完全抗体

临床应用： • 在输血上的应用 • 血型抗原抗体的检查 • 对新生儿溶血性贫血性疾病的诊断 • 对溶血性贫血的研究 • 对细菌或立克次体的不完全抗体检查

梅毒螺旋体的血清学检测（间接凝集反应） 1.梅毒螺旋体属于密螺旋体属苍白螺旋体的苍白亚种，是一种小而纤细的螺旋体状微生物，螺旋密而规则，两端尖直，运动活泼，镀银染色为棕褐色，抵抗力极弱，是引起人类梅毒的病原体。

2.人是梅毒的唯一传染源，可经性接触、输血及母婴垂直传播。本病几乎可侵犯全身各个器官，病期长，临床症状复杂。2.人是梅毒的唯一传染源，可经性接触、输血及母婴垂直传播。本病几乎可侵犯全身各个器官，病期长，临床症状复杂。 3. 梅毒螺旋体检查是对早期现症梅毒检测的最好方法，但是梅毒螺旋体不能在人工培养基上生长，目前只能将其接种于家兔睾丸内来保存和传代。

4. 临床血清试验分为两大类： 一类为非梅毒螺旋体抗原血清试验，包括常用性病研究实验室试验 (VDRL)、不加热血清反应素试验(USR)、血浆反应素环状卡片试验(RPR、TRUST)，主要应用于初筛试验和疗效观察；另一类为梅毒螺旋体抗原血清试验，常用有荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)、ELISA、梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)、梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA) 等，主要应用于确证试验。

快速血浆反应素环状卡片试验(rapidplasmareagincirclecardtest,RPR)快速血浆反应素环状卡片试验(rapidplasmareagincirclecardtest,RPR) 1）原理：梅毒患者血清中存在着能与VDRL（性病研究所实验室）抗原发生凝集反应的反应素，本试剂利用这一原理，将VDRL抗原吸附于活性炭颗粒表面，当待测血清中存在反应素时，即与其发生凝集反应，出现肉眼可见的黑色凝块。 2）VDRL抗原：牛心磷脂、卵磷脂和胆固醇组成。

梅毒甲苯胺红不加热血清试验(tolulizedredunheatedserumtest,TRUST)梅毒甲苯胺红不加热血清试验(tolulizedredunheatedserumtest,TRUST) • 原理 TRUST试验原理与RPR试验原理相同。唯TRUST抗原中加入甲苯胺红染料颗粒代替碳颗粒作为指示物，使阳性结果出现红色絮状凝集现象，阴性结果见甲苯胺红颗粒集于中央一点或均匀分散。

方法： 1．定性试验: (1)分别吸取50uL阳性对照、阴性对照、待测血清于三个卡片圈内； (2) 将TRUST抗原悬液抗原摇匀，每孔加入50ul ； (3)将卡片置旋转器旋转8分钟，(100±5转)/min； (4)立即在强光下观察结果。结果： (1)圆圈内出现小至大的红色絮状物为阳性，不分其阳性的程度。必要时可依絮状物的大小和多少，用“＋”号表示。 (2)圆圈内仅见甲苯胺红颗粒集于中央一点或均匀分散为阴性。

方法： 2．定量试验(在纸卡上进行)： (1)在纸卡圆圈内加入50uL生理盐水(一般做6个圆圈)，勿将盐水涂开； (2)吸取50uL血清作倍比稀释(1:2~1:64)，最后所稀释的圆圈内应弃去50uL； (3)滴加50uL抗原悬液、混匀。旋转时间和速度、观察结果同定性试验。

思考题 1.凝集反应有哪些？有何优缺点？ 2.梅毒检测程序？

梅毒螺旋体血清学检测 （间接凝集法）