INGEGNERIA GENETICA

1. INGEGNERIA GENETICA

2. INDICE • Nozioni generali su DNA • HNPCC ( Hereditary non-poliposys colon cancer ) • Referto genetico • Bibliografia e Linkografia

3. NOZIONI GENERALI SUL DNA • Il Dna è il materiale genetico che gli organismi ereditano dai loro genitori • E’ una macromolecola composta da due catene avvolte a doppia elica di nucleotidi • Un nucleotide è formato da una molecola di deossiribosio, un gruppo fosfato e una base azotata • Le basi azotate del Dna sono quattro: la timina e la citosina hanno una struttura ad anello singolo e sono dette pirimidine;l’adenina e la guanina hanno una struttura a doppio anello e sono dette purine

4. Al fine di mantenere i due filamenti di Dna a distanza costante una Timina è sempre associata a un’Adenina; e una Citosina è sempre legata a una Guanina Ogni tripletta di basi azotate codifica per un’amminoacido ( attraverso la trascrizione e la traduzione ) Il Dna all’interno del nucleo si trova più volte ripiegato, in modo da poter contenere una maggiore quantità di informazioni. Il primo livello di ripiegamento avviene grazie all’utilizzo di un gruppo di 8 istoni, il cui complesso prende il nome di nucleosoma

5. HNPCC ( Hereditary non-polyposis cancer colon ) Amsterdam criteria I:3 parenti stretti in 2 generazioni devono avere manifesto questo tipo di cancro sotto i 50 anni Associato a tumori al l’endometrio, all’utero,all’intestino tenue e ai reni. SINROME di DEFICIENZA del MMR(mismatch repair ) SYSTEM Gran parte delle mutazioni riguardano i geni MSH2 e MSH1, che producono proteine indispensabili per MMR Possibile relazione tra il sistema MMR e le stazioni di controllo G1/s e G2/M della riproduzione cellulare Può essere dovuto anche ad una non attivazione dei geni come conseguenza di: ipermetilazione del promotore, perdita dell’eterozigosità, nutazioni somatiche MSI

6. REFERTO GENETICO • ESTRAZIONE DEL DNA • PURIFICAZIONE • PCR • Replicazione del dna nelle cellule • SOUTHERN BLOT • SEQUENZIAMENTO • Grafico • Il Codice Genetico

7. ESTRAZIONE DEL DNA Ci sono tre procedimenti principali nell’estrazione del DNA.I dettagli invece possono variare a seconda del tipo di campione e a seconda delle sostanze presenti, che possono interferire con l’estrazione e le successive analisi: 1. Demolizione della struttura cellulare e rimozione dei lipidi delle membrane attraverso l’azione di un detergente. 2. Digestione delle proteine, in particolare degli istoni, aggiungendo l’enzima proteasi, o attraverso la precipitazione tramite sodio o acetato di ammonio, oppure utilizzando l’estrazione con fenolo-cloroformio. (La digestione delle proteine è la loro demolizione fino ad amminoacidi) 3. Precipitazione del DNA in freddo etanolo o in isopropanolo.Il Dna è insolubile nell’alcol e si lega con quest’ultimo; in questo modo vengono rimossi anche i sali. REFERTO GENETICO

8. PURIFICAZIONE DEL DNA • La purificazione è necessaria prima di effettuare la PCR in modo da avere dentro la provetta solo il dna del paziente in soluzione • Per effettuarla vengono utilizzati determinati kit preconfezionati i cui principali step sono: • Diluire la soluzione con Elution Buffer • Centrifugare in modo tale che il dna scenda nella provetta (n.4,fgr) separandosi dagli altri componenti e da eventuali impurità REFERTO GENETICO

9. PCR ( Polymerase chain reaction ) • La PCR è un metodo alternativo che permette di ricavare un numero indefinito di copie del dna di interesse , senza i tagli e le ricuciture tipici del clonaggio, purché se ne conosca almeno in parte la sequenza • Il principio base della PCR, che le conferisce andamento esponenziale, è quello di utilizzare del filamento prodotto in un ciclo come stampo per il ciclo successivo • Per evitare che l’enzima si denaturi e debba essere aggiunto ad ogni ciclo, è molto utile la dna polimerasi termostabile di un microrganismo termostabile, come il Thermus Acquaticus COMPONENTI: • gDNA • Taq polimerasi • Buffer • MgCl2 • FW-RV primers • H2O • dNTPs • DMSO100% REFERTO GENETICO

10. Replicazione del Dna nella cellula • E’ importante sottolineare l’utilizzo di pochi fattori nella PCR rispetto a quelli impiegati in una normale replicazione del dna all’interno di una cellula, come avviene nel clonaggio del DNA REFERTO GENETICO

11. SOUTHERN BLOT • E’ un tipo di elettroforesi su gel che permette di identificare le dimensioni dei frammenti di dna • Si immerge il gel ( TBE 10x;Agarosio 2%;Bromuro di etidio), munito di pozzetti, nella soluzione di TBE 10x • All’interno dei pozzetti viene inserito il dna marcato e un marker • Applicando una ΔV di 100 V tra i due elettrodi il dna migra verso il polo positivo e si posiziona tra le maglie del gel a seconda della sua lunghezza • Infine la posizione in cui la sonda si ibrida sul blot può essere rilevata con una serie di film sensibili alla luce o agli elettroni emessi dal dna marcato REFERTO GENETICO

12. REFERTO GENETICO

13. SEQUENZIAMENTO • L’obiettivo del sequenziamento è quello di determinare l’ordine dei nucleotidi in un gene • Viene utilizzato un solo primer e quindi solo un filamento viene copiato • Alla fine vengono fatti correre i filamenti, di diverse lunghezze che terminanti con un ddNTP marcato, su un gel di poliacrilamide che può separare molecole che differiscono si una sola base • Analisi del dna tramite un spettrografo REFERTO GENETICO

14. Grafico del sequenziamento SEQUENZIAMENTO

15. IL CODICE GENETICO REFERTO GENETICO

16. BIBLIOGRAFIA E LINKOGRAFIA • Päivi Peltomäki, Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon cancer,Oxford University Press,15 gennaio 2001 • R. L. Nussbaum-R. R. McInnes-H. F. Willard,Thompson & Thompson Genetics in Medicine,Saunders,2004 • G. Gibson-S.V. Muse, Introduzione alla Genomica, Zanichelli, Bologna 2004 • www.molecularlab.it • www.macgn.org