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人类淋巴细胞培养 和染色体标本的制备

遗传病的分析 3. 人类淋巴细胞培养 和染色体标本的制备. 原 理. 在细胞的生长周期中，中期染色体的长短、大小、恒定性正适合我们对其进行分析、研究。 因此利用人工的方法，使大部分分裂细胞处于中期而不向后期转化，并获得之，经处理，制片后观察分析。. 器材与试剂. 器材 ： 人外周血 5ml 。 培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天平等。 试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰载玻片等。. 器材与试剂. 试剂： 肝素 含 10% 小牛血清 RPMI1640 植物血凝素（ PHA） 秋水仙素（ 5 微克 / 毫升）

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人类淋巴细胞培养 和染色体标本的制备

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Presentation Transcript

  1. 遗传病的分析3 人类淋巴细胞培养 和染色体标本的制备

  2. 原 理 • 在细胞的生长周期中，中期染色体的长短、大小、恒定性正适合我们对其进行分析、研究。 • 因此利用人工的方法，使大部分分裂细胞处于中期而不向后期转化，并获得之，经处理，制片后观察分析。

  3. 器材与试剂 器材 ： • 人外周血5ml。 • 培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天平等。 • 试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰载玻片等。

  4. 器材与试剂 试剂： • 肝素 • 含10%小牛血清RPMI1640 • 植物血凝素（PHA） • 秋水仙素（5微克/毫升） • 0.075MKCl， • 固定液（甲醇/冰乙酸3:1） • Giemsa染液。

  5. 操 作 1、采血：取血3-5ml,肝素抗凝。 2、接种： 5ml培养液中加入0.3-0.5ml全血并摇匀，每份血样接种2瓶，置37℃,培养72h。 3、秋水仙素处理：终止培养前1.5-2h加秋水仙素（终浓度为0.07ug/ml），混匀，37℃继续培养。 4、收集细胞 ：将培养细胞混匀吸入刻度离心管（2瓶培养物吸入1支刻度离心管内），1500r/min离心，10min。 5、低渗处理：弃上清，加8ml 0.075M KCl溶液，混匀，置37℃水浴20min。

  6. 操 作 6、预固定 ：低渗处理后，加1ml固定液混匀，5min后1500r/min离心，10min。 7、固定 ：弃上清，加8ml固定液，混匀，室温静置30min，1500r/min离心， 10min。 8、再固定 ：同上（省略）。 9、制备细胞悬液 ：弃上清，视细胞数量多少加适量固定液制成细胞悬液。 10、制片 ：取细胞悬液2-3滴，滴于冰玻上，并迅速吹片，酒精灯火焰烤干。 11、观察： Giemsa染色，5min，自来水冲洗，镜检。

  7. 结 果 光镜100倍下人染色体G带照片

  8. 注意事项 • 培养温度应严格控制在37℃±0.5℃。 • 培养液的pH值7.4±0.1，偏酸细胞发育不良，偏碱则细胞出现轻度固缩。 • PHA的质量和浓度很关键，它对淋巴细胞的刺激效应有个体差异较大。 （肝素） • 秋水仙素一般最终浓度以0.04-0.08ug为宜，处理时间为1-4h。 • 低渗的浓度与时间应掌握好。 • 固定液应临用时新鲜配制，固定时一定要彻底打匀。

  9. Thank You !

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