结核病实验室质量保证及快速诊断进展

1. 结核病实验室质量保证及快速诊断进展 国家结核病参比实验室 赵雁林 Zhaoyanlin@tb123.org

2. 内容 • 结核病实验室工作在结核病控制中的作用 • 为什么要进行EQA • EQA 培训的重要意义 • 4. 结核病实验室相关的流行病学理论 • 5. 痰涂片镜检的操作原理 • 6. 全球结核病快速诊断进展

3. 诊断 （发现传染源） 治疗 （确定治疗方案） 疗效评价 结核病控制策略和措施的评估 结核病实验室工作在结核病控制中的作用

4. Diagnosis of Pulmonary TB Relatedto Numbers of Tubercle Bacilli 10 102 103 104 105 106 Poor microscopy (25%) X-ray/clinical only (20%) Culture / PCR (25%) Good microscopy (55%) ← AFB per ml of sputum Slide Courtesy: Van Deun A, Nov 2003

5. 细菌 – 让人们联想到什么? • 疾病 • 传染性 • 流行性 • 食物腐败 • 在目前已知的细菌中有1%的细菌可以导致人患病 • 在目前已知的细菌中有4%的细菌可以导致植物得病 95%已知细菌不具有致病性

6. 为什么要进行EQA • 增加人员的责任心 • 推行标准化、规范化操作 • 确保实验室服务质量的提高 • 生物安全的需要 • 加强实验室网络、采集信息

7. 痰涂片镜检EQA 培训的意义 • 强化EQA的理解，有利于积极推广 • 提高实验室服务质量 • 提高对结核病实验室工作的重视 • 逐步提高结核病防治人员特别是结核病实验室工作人员的地位

8. 结核病实验室相关的流行病学理论 • 结核病的发病学和流行 • 冰山理论 • 水库理论 • 病因分析和疗效评价

9. 生命的5 个基本特征 • 1. 细胞 • 2. 通过从环境中摄取化合物和能量维持其结构 • 3. 对外部刺激的反应性 • 4. 复制、繁衍并传递给其子代遗传信息 • 5. 进化适应环境

10. 结核分枝杆菌在人体中的生活周期 感染 – 95% 感染 病变早期进展 - 5% 后期表现 - 5% 例如： HIV, 婴幼儿 例如：移民

11. 结核分枝杆菌的生活周期 感染 人体内生存 由肺中排入空气中 进入细胞内 侵犯人体免疫防御系统 免疫病理 免疫激活和营养限制 改变细胞壁 改变营养需要 释放抗原性蛋白 释放调控因子, 例如 sigma factors

12. 微生物和人类 Very few microbes are always pathogenic Many microbes are potentially pathogenic Most microbes are never pathogenic

13. 我们如何知道特定的病原微生物致病? 诊断和有效的治疗不仅依靠分离病原微生物，而且在于建立实验室和病人临床症状的联系 Recognised syndromes e.g. septicaemia, endocarditis, osteomyelitis meningitis, UTI, pneumonia pharyngitis patient's clinical condition potential pathogen isolated from or detected in clinical samples

14. 如何推测特定病原体可以致病? • Koch‘s 推测 • 病原体必须在每一例病例中都出现 • 病原体可以从宿主中分离并且可以在纯培养基中生长 • 当特定的病原体接种到健康机体时特定的疾病会发生 • 病原微生物可以在实验动物中恢复

15. 传染性疾病的冰山理论 poliomyelitis in a child 0.1-1% of infections are clinically apparent classical clinical disease less severe disease rubella 50% of infections are clinically apparent asymptomaticinfection Spectrum ofvirulence rabies 100% of infections are clinically apparent

16. 水库理论 发病人数 死亡人数 现有病人数 治愈人数

17. 痰涂片镜检的操作原理

18. 分枝杆菌的发现历史 • 1590 年荷兰杨森父子发明了显微镜 • 19世纪末,显微镜技术、染色技术已应用于微生物检测,分枝杆菌的发现条件已成熟 • 在发现结核菌前,科霍已是一位在微生物学方面取得丰硕成果的学者.

19. Robert Koch–第一个证明细菌可以致病 • 1876 • 传染病的微生物病因学 • 病因学 - 疾病的病因 • 建立 “科学规则” 来确定微生物和疾病的病因和效应关系 • Koch’s 原理

20. Koch确定了3个重要疾病的病因 • 1. 霍乱 (fecal-oral disease) • Vibrio cholerae • 2. 结核病 (pulmonary infection) • Mycobacterium tuberculosis • 3. 炭疽(sheep and cattle) • Bacillus anthracis

21. 结核病 • 结核分枝杆菌：棒状抗酸菌. 可以在人与人之间传播 • 牛型结核杆菌: 美国的病例数〈１％,不在人与人之间传播 • 鸟胞内分枝杆菌，可以感染AIDS晚期患者 Figure 24.9

22. 分辨率和对比度 • 人的肉眼不能看清小于0.1毫米的物体 • 普通光学显微镜不能区别小于0.2微米的物体 • 电子显微镜不能看清小于0.1纳米的物体

23. 光学显微镜的基本原理 • 为区分物体不同的两点,这两点的光学成像必须落在视网膜上不同的感光细胞上; • 显微镜下,光线经过显微镜物镜折射成倒立放大的实像,然后经目镜折射成正立放大的虚像; • 经显微镜放大后,人眼就可以区分物体不同的两点,以达到观察微小物体的目的; • 由于光线衍射的原因,普通光学显微镜不能区别小于0.2微米的物体；

24. 电子显微镜下的结核分枝杆菌

25. 生理条件下细菌的表面往往带有大量负电荷 • 原因：细菌表面带有正负电荷的基团，等电点多在PH７以下，因此在中性或碱性条件下细菌的表面往往带有大量负电荷

26. 染色反应 • Stains - salts composed of a positive and negative ion, one of which is colored (chromophore) • 碱性染料 – 着色基团带正电荷 • dye+ Cl- • 酸性染料 – 着色基团带正电荷 • Na+dye-

27. 分枝杆菌涂片镜检基本原理 １、待检标本中存在分枝杆菌，即受检者排菌 ２、分枝杆菌的特殊结构决定了染色方法： 　　　染色剂 细菌表面带负电荷,与碱性复红易于结合, 　　　　加热 加深分枝杆菌着色程度 　　　　脱色 为了易于镜检，应该使抗酸菌以外的所有物质近乎完全脱色 　　　　复染 提供一个良好的对比，隐去背景中残留的红色，但不掩盖抗酸菌。而且，复染既要使涂片的背景易于镜检时调焦，同时又不能太深以至分散太多注意力

28. 结核菌感染及排出示意图

29. 结核病

30. 结核病

31. 细胞壁 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 分枝杆菌 acyl lipids 脂质双分子 porins 肽聚糖 LAM MYCOLATE arabinogalacta lipid + LPS

32. 细胞膜 • 两种主要结构成分 • 双层磷脂　double layer of phospholipids • 蛋白质　　proteins

34. Cell Membrane

35. 1. 痰涂片操作程序原理 2. 二甲苯问题

36. 产生错误结果的常见原因 假阴性假阳性 技术错误 涂片: 太薄/太厚、暴露在紫外线下标本中的混杂物质 / 加热时间过长 / 使用污染的木签 染色: 染色质量不佳、未热染、染色时结晶/环境抗酸菌、 间太短、脱落、涂片未固定交叉污染 脱色: 脱色不佳 脱色不佳 复染: 过染染色不佳 镜检员视力缺陷、仅观察少数视野、经镜油交叉污染 读片错误：未经培训 未经培训 记录/报告：记录错误 记录错误

37. 细菌感染的诊断 Non-microbiological investigations 病人 临床诊断 影像学 血液生化 标本 分泌物 标本

38. 实验室检查是临床诊断的必要环节

39. OUTLINE • 细菌学诊断 显微镜检查术 培养 • 免疫学诊断 • 分子生物学诊断 Gen Probe 噬菌体检测方法 HPLC 其他

40. 结核分枝杆菌的细菌学诊断 显微镜检查 unstained or stained with e.g. Gram stain 染色 脱色 复染 identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony 培养 on plates or in broth 药敏 by disc diffusion methods, breakpoints or MICs DNA 方法 血清学

41. 显微镜检查 • Gram-染色 • 抗酸染色 • Ziehl-Neelsen • 荧光染色 • Direct, e.g. auramine • Immunofluorescence

42. 培养 • Solid media • Agar plates • For Identification • For Enumeration • Slopes • For safe long-term culture, e.g. Lowenstein-Jensen media for TB • Liquid media (broth) • For enrichment or maximum sensitivity

43. 菌种鉴定 • 形态学 • 生长条件 • 生化反应 • 酶 • 抗原 • 分子生物学方法

44. 非培养的诊断方法 • 血清学检测 • 分子生物学方法 • 其他（HPLC）

45. 讨论的议题 • 什么是分子生物学诊断方法 ? • 为什么用分子生物学诊断方法 ? • 可得的分子生物学方法? 45

46. 分子生物学方法是传统方法的必要补充 • 显微镜检查有假阳性 - T.vaginalis, N.gonorrhoeae • 胞内致病菌 – viruses, M.genitalium • 低敏感性 – Chlamydia sp.,Neisseria sp. • 慢速生长 – M. tuberculosis

47. 分子生物学方法 – 如何发挥作用? • 每个微生物拥有一些种属特异的DNA序列 • 分子生物学方法使得种属特异性DNA可以衡量 法医鉴定

48. 分子生物学方法是一系列DNA初级结构的方法 • 杂交的互补序列方法 -A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G- - T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C- • 扩增合成种属特异的DNA序列 -A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G- -A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G- -A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G- -A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G- -A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-

49. PCR 实验室 QC & QA 质量控制和质量保证 标本处理 DNA 准备 No alternative 混合点 热循环和扩增 检测 洁净屋 储存溶液 R & D Alternatives: - commercial kits - robots + kits

50. Bactec呼吸测定 ①Bactec放射呼吸测定 以含有放射标记的软脂酸为底物的液体培养基，自动测量分枝杆菌代谢14C软脂酸脱致过程中释放的14CO2的量。该法药敏报告可缩短为4一12天。 ②分枝杆菌生长指示管法 Bactec放射呼吸测定法的替代方法。以培养基中加入荧光钌复合物代替放射性标记，其荧光衰减与细菌代谢过程中O2的消耗量有关。荧光衰减可通过一系列不同的紫外透照管检测。