TAHRAN’DA HOSPİTALİZE ÇOCUKLARDA İNSAN ROTAVİRÜS GENOTİP TAYİNİ

1. TAHRAN’DA HOSPİTALİZE ÇOCUKLARDA İNSAN ROTAVİRÜS GENOTİP TAYİNİ Yrd. Doç. Dr. Mehmet Özdemir Dr. Özlem Aydemir

2. Human Rotavirus Genotypes Detection amongHospitalized Children, A study in Tehran, Iran ShahrzadModaress , Ali AkbarRahbarimanesh , RositaEdalat, Amir Sohrabi, ShahabModarres, HosnaGomari, MahdiehMotamedirad, Ali AkbarSayariArchives of Iranian Medicine, Volume, Number , January 2011 39

3. ÖZET • İnsan rotavirus G1,G4, G9,P4,P8 genotipleri dünya genelinde çocuklardaki gastroenteritlerin majör sebebidir. • Bazı ülkelerde G1P8 genotipi baskındır. • Bu çalışmada 2004- 2008 yılları arasında Tahran’da diare ve dehidratasyon sebebiyle tedavi edilen 5 yaş altı çocuklarda grup A rotavirusungenotipik çeşitlilikleri araştırıldı.

4. Metod: • Çocuklardan 700 örnek toplandı ve dsRNA_ PAGE (polyacrylamide jel elektroforezi) tekniği ile rotavirusun varlığı değerlendirildi. • Pozitif örnekler de semi_nestedmultipleks PCR ile G ve P tipleri tanımlandı.

5. Sonuç: • Örneklerin %19’unda rotavirus izole edildi. • Elektroforez ile farklı 14 rotavirusdsRNA’sı tanımlandı. • Hakim genotip sırasıyla G1(%76.3), bunu takiben G4(%0.8), P4(%9.2),P8 ((%66.4) idi. • Miks tiplerden G1P8(%53.4), G1P4(%9.2) ve G4P8 (%4.6) en sık görülenlerdi.

6. Tartışma: • Bu çalışma ile Tahran’da çocuklarda gastroenterite sebep olan genotip en sık G1P8 bulunmuştur. • G ve P genotiplerinin diğer Asya ülkeleri ile yüksek oranda benzerlik gösterdiği görülmüştür. • Bu veriler gelecekte İran’daki aşı formülasyonları için güvenilirdir.

7. GİRİŞ: • Akut gastroenteritler dünya genelinde çocuklardaki morbidite ve mortalitenin majör sebeplerindendir. • Her yıl dünya genelinde 125 milyondan fazla rotavirus sebepli gastroenterit görülmekte ve bunların yaklaşık 500 bin tanesi ölümle sonuçlanmaktadır.

8. Çocuklardaki gastroenteritin en sık etyolojik ajanı Reovirus ailesinden rotavirus sınıfının alt türü grup A rotavirüstür. • Rotavirus 11dsRNA segmentli çekirdek ve onu çevreleyen üç katlı (cor, iç ve dış) kapsidden oluşur. • Rotaviruslerantijenik yapısına göre 7 majör gruba ayrılır.(A-G). • Grup A rotavirus çocuklardaki akut dehidratasyon ve gastroenteritin majör sebebidir.

9. Grup A rotavirusler VP4 ve VP7’nin antijenik özelliklerine göre P ve G tiplerine ayrılmışlardır. • Rotaviruslerin 23G, 31’den fazla Ptipi tanımlanmış olmasına karşın insanlarda 10G,11P tipi bulunmuştur. • Çocuklarda akut gastroenterite en sık yol açan G1 rotavirustür.

10. Dünya genelinde G ve P genotiplerinin yaygın olarak 5 kombinasyonu vardır. • En sık görülen kombinasyonlar; P8 ile G1,G3,G4,G9 kombinasyonları ve P4-G2 kombinasyonlarıdır. • Rotavirusların bölgesel yaygınlığı ve tiplendirmesinin yapılması aşı hazırlanması için önemlidir.

11. Bu çalışmada Tahran’da iki hastanede yatan akut gastroenteritli çocuk hastalarda grup A rotavirusinsidansı araştırıldı. • Aynı zamanda infekte çocuklardaki rotavirussuşunun P ve G genotipleri araştırıldı.

12. MATERYAL-METOD • 2004-2008 yılları arasında 2 hastanede yatan gastroenteritli çocuklardan 700 fekal örnek toplandı. • Hastalarda kusma, ateş, dehidratasyon, abdominal ağrı gibi semptomlar vardı. • Hastaların yaş aralığı 1 ay ile 5 yaş arası idi. • Fekal örnekler Pasteur Enstitüsü Viroloji Bölümüne gönderildi. • Örnekler çalışma yapılana kadar -20 derecede saklandı

13. ROTA VİRÜS SAPTANMASI VE ELEKTROFOREZ İLE TİPLENDİRME • Rotavirüs pozitif fekal süspansiyonların viralds RNA’sının ayrımı için QIAampviral RNA kiti kullanıldı. • Tanımlanan dsRNAnınpolyacrylamide gel elektroforeziile grup A rotavirüslerin tiplendirmesi yapıldı. • VP4 ve VP7 genomları RT-PCR kullanılarak tespit edildi. • G ve P genotipleri ise seminestedmultipleks PCR ve tipe spesifik primerler kullanılarak saptandı.

14. ELEKTROFOREZ İLE TİPLENDİRME • Elektroforez ile tiplendirme için sodyum dodecyl-sülfat içeren %10luk ekstraksiyonbuffer hazırlandı. • Süspansiyon eşit dozda fenol/kloroform ile karıştırıldı ve santrifüj edildi. • Santrifüjinasyondan sonra ds RNA etanol ile çöktürüldü ve dietilpyrokarbonatlı su ile yeniden süspanse edildi. • %10’luk polyacrylamid jelde 30 µl RNA’nın elektroforeziyapıldı. • Jel gümüş nitrat ile boyanarak fotoğraflandı.

15. G VE P GENOTİP TAYİNİ • P ve G genotip tayini için 10 nMbuffer, 50nM MgCl2, 10nM deoksinükleotidtrifosfat karışımı , 10µL primerden oluşan 25 µl solusyondaamlifikasyon yapıldı ve 3 µl cDNA üretildi • Denatürasyon aşamasında 94 °C de 5 dakika , uzama aşamasında 72 ˚C de 7 dakika tutuldu. • PCR ürünleri trisboratebufferli %1.5 agaroz jel elektroforezi ile ultraviole ışığı altında görüntülendi.

16. Nükleotid ve aminoasit dizisinin filogenetik dizisi • Aminoasit ve VP4 ve VP7 nükleotid dizisinin kısmi analizi edildi. • Sonuç olarak Clustel metodu kullanılarak iki filogenetik ağaç oluşturuldu.

17. SONUÇLAR • 700 örneğin 131 tanesinde dsRNApolyacrylamide jel elektroforeziile grup A rotavirüs tespit edildi. • Geriye dönük 4 yıllık çalışma boyunca rotavirusinsidansları tespit edildi. • Kasım 2004’te %25.7, kasım 2005’te %22.1, kasım 2006’da %20.6, kasım 2007’de %32 idi.

18. Çalışma bölgesinde elektroforezile kısa ve uzun profilde14 farklı rotavirüs tanımlandı. • G2 ve G8 rotavirüsleri kısa RNA paterni gösterirken , G1 suşu uzun RNA paterni gösterdi.

19. G VE P GENOTİP AYIRIMI • Semi nestedmultiplex PCR ile örneklerin 120 tanesi G, 101 tanesi P genotipi olarak tanımlandı. • G genotiplerinden %76.3 ile G1 genotipi baskınken bunu %11.5 ile G4 ve %3.1 ile mix tip takip etti. • 2004’ün soğuk aylarında 2 örnekte G1G2 miks tipi gözlemlendi. • Bu çalışmada 2004- 2008 arasında G1genotipinden sonra en baskın G4 genotipi bulundu. • Bunların takibinde P tipleri bulundu.

20. %66.4 P8, %9.2 P4 görüldü. • 2004 -2008’in soğuk ve sıcak aylarında G1P8 %53.4 ile baskın genotipti. • Diğer görülen genotiplerse G1P4(%9.2), G4P8 (%4.6 ) idi. • Toplam örneğin %22 sinde yalnızca G tipi, %8.4 ünde P8 tipi izole edildi. • 4 örnekte karışık G tipi (G1/G4P8, G1G4P8, G1G1-P) enfeksiyon görüldü.

21. VP4 -VP7 KISMİ DİZİ ANALİZİ • Bu çalışma süresince G1, G2, G4, G8, P4, P8 içinVP4 ve VP7 nükleotid dizileri belirlendi. • Kasım 2004 ve Eylül 2008 arasında G1 izolatlarının oranı %99 benzerdi. • Bu çalışma periyodunda G1 suşlarının %50’si G1P8 ve yaklaşık %10’ u G1P4 olarak izole edildi. • Bu çalışma periyodu boyunca analiz edilen G4 suşları %98 oranında diğerleri ile benzerdi.

22. TARTIŞMA • Diare dünyada 5 yaş altı çocuklarda en sık ikinci ölüm nedenidir. • Çocuklardaki ciddi diarenin en sık sebebi ise rota viruslerdir. • Farklı coğrafik bölgelerde farklı rotavirusleringenotipprevalansı ve onların genetik çeşitliliği aşı çalışmalarına rehberlik eder. • Bu çalışmada akut gastroenterit sebebiyle hospitalize edilen 5 yaş altı çocukların %19’unda rotavirüs ilişkili bulunmuş.

23. Bu hastalarda rotavirüsdsRNA’sınıngenotipik tanımlaması elektroforez ile yapıldı. • Bu çalışmada İran’da G1 genotipi %76.3 ile baskın olarak raporlandı. • Bunu G4 (%11.4) veG8 (%0.8) takip etti. • 2004-2008 yılları arasında Tahran’da G1 genotipi baskınken; Japonya, Tayland gibi Asya ülkelerinde G9 baskındı.

24. Bu çalışmada baskın olan kombine tip G1P8 idi. • Dünya genelinde G1,G2,G3,G4,G9 genotipleri ve P4, P6, P8 kombine tipleri raporlanmıştır. • Türkiye’de G4P8(%42),G1P8 (%27) genotipleri raporlanmıştır. • Bangladeş’te %50’den fazlasında G1P8veG2P4 görülmüştür.

25. Hollanda, Brezilya, Hindistan gibi ülkelerde G1P8 hakimken, Amerika, Kore, Arjantin gibi ülkelerde G1P4, G2P4, G4P8, G9P8 zinciri hakimdi. • Bu çalışmada RNA elektroforezi ile G1 suşunun iki ayrı kümesi oluşturuldu. • Birinci kümedeki G1 suşu Tayland’daki G1 suşu ile %99 oranında benzerken, ikinci kümedeki G1 suşu Japonya’daki suşla %98 oranında benzerdi.

26. Bu çalışmada G1 suşundan analiz edilen VP7 geni nde önemli olmayan değişiklikler tespit edildi. • Bu bulgular son zamanlarda Japonya, Tayland, Çin Vietnam gibi ülkelerde yapılan çalışma sonuçları ile benzerdi. • Kısa RNA profili ile izole edilen rotavirusun VP7 geninin kısmi analizi ,Tayland’da 2003 yılının epidemik mevsiminde yeniden ortaya çıkan G2P4 suşu ile yakından ilişkili (%99) görülmüştür.

27. G4 izolatlarıHindistanda‘ki suşlarla %99 oranında benzerdi. • Analiz edilen P8 suşları, her bir nükleotid sekansıyla identifiye edilen suşlara ve Asya kümesine aitti.

28. Bugün rotavirüs hastalığından korunmak için G1P8 kökenli canlı attenueaşılar (Rotarix) tavsiye edilmektedir. • Bu aşıların G1, G3, G4, G8 ile P8 ‘i sebep olduğu rotavirus enfeksiyonlarında etkisi görülürken, bazı ülkelerde G2P4 suşuna düşük etki gözlenmiştir. • Bu bulgular aşılama programına oldukça yol gösterici olacaktır. • Bu çalışma epidemiyolojik çalışmalar ve gelecekteki aşı formülleri için güvenli veriler sağlamıştır.

29. ROTAVİRUS • Rotavirüsler çift kapsidli, sitoplazmada replike olan zarfsız virüslerdir. • Dış kapsid, P proteini olarak adlandırılan VP4 ile G proteini olarak adlandırılan VP7 proteinlerinden oluşmuştur. • VP4 dikensi çıkıntılar oluşturarak hemaglütinin görevi yapar ve nötralizan antikorların hedefidir.

30. VP4 proteini rotavirüslerde P genotipini belirlemede kullanılır. • VP7 de nötralizan antikorların hedefidir ve G serotipini belirlemede kullanılır. • Grup A rotavirusler VP7 ve VP4 proteinler temel alınarak serotiplere ayrılır. • İç kapsidde hakim olan VP6 proteinidir ve bundaki yapısal değişikliklere göre rotaviruslar 7(A-G) gruba ayrılır.

31. ROTAVİRUS AŞILARI • İlk rotavirus aşısı tetravalan maymun- insan reassotant(Rotashield) aşı ABD’de 1998’de ruhsat almıştır. • Aşı ile invaginasyon arasında ilişki olduğu gerekçesiyle toplatılmıştır. • Sonraki yıllarda iki yeni aşı (Rotarix/G1P8, Rotateg) yaklaşık 90 ülkede ruhsat almıştır. • Halen ABD, Brezilya, Meksika, Avusturya gibi ülkelerde rutin aşı uygulamasında yapılmaktadır.