第九章遗传的分子基础

第九章遗传的分子基础 教学目的和要求 1. 了解DNA作为遗传物质的3个证据 2. 掌握核酸的化学结构（DNA、RNA） 3. 掌握原核生物和真核生物染色体的分子结构 4. 掌握DNA的半保留复制特点 5. 掌握三种RNA分子的合成特点、转录及加工

导入：基因是由什么物质组成的？它又是如何控制性状的发育呢？导入：基因是由什么物质组成的？它又是如何控制性状的发育呢？ • 染色体由蛋白质和核酸等构成，二者都是长链状分子的多聚体，由相似而非等同的亚单位通过化学链结合在一起。 • 蛋白质最基本的单位是氨基酸，最常见的有20种不同的氨基酸，一个蛋白质分子可由几百——几千个氨基酸构成，它们的排列组合是一个天文数字。 • 核酸的最基本单位是核苷酸，只有四种，排列组合数要小得多。 • 那么，遗传物质究竟是蛋白质还是核苷酸呢？

实验一：肺炎球菌的转化实验 • 1928年，Fred Griffith 肺炎球菌（Pneumococcus）（a）S strain kills mouse+ Live mouse →Dead mouse （b） R strain does not kill mouse + live mouse→ live mouse （c） Head—killed S strain does not kill mouse + live mouse→Live mouse （d） R strain plus heat—killed S strain，both of which are separately nonlethal，kill mouse + live mouse→Dead mouse

Griffith的实验证明：细胞液中含有一种性质不明的转化因子？Griffith的实验证明：细胞液中含有一种性质不明的转化因子？ • Lysis，precipitation cell-free extract S StrainTransforming principle from S strain +粗糙型 Grouthboth S and R cells • 1944年，Avery、Maclead and McCarty从细胞抽提液中部分纯化了转化因子，证明是DNA。

实验二、噬菌体的侵染和繁殖（捣碎器实验） • 由Alfred Hershey and Martha Chase完成 DNA（can be labeled with 32P） protein（ can belabeled with 35S） injection After blending lncubation

实验三、病毒的拆开和重建实验 • 1956年，Fraenkei-Courat用烟草花叶病毒（TMV） Ⅰ型TMV RNAⅠ 感染烟叶 Ⅱ型TMV RNAⅡ 结论：RNA有时也是遗传物质

DNA和RNA的分子结构和复制 • 一、DNA的分子结构 • DNA分子是去氧核糖核苷酸的聚合物，每个核苷酸均由一个五碳糖分子、一个磷酸分子和一个含N的有机碱基组成。 • 腺嘌呤A 胸腺嘧啶T 胞嘧啶C 鸟嘌呤G 稀有碱基：5-甲基胞嘧啶； 6-甲基氨基嘌呤碱基结构见刘祖洞P87 DNA的一级结构见P88（骨架由相间的磷酸和脱氧核糖基团通过3ˊ、5ˊ磷酸二酯键连接起来，四种核苷酸碱基之一搭到每个脱氧核糖的1ˊ碳原子上）。

Watson—Crick模型（P90） • 1、早期的DNA物理学研究表明，DNA分子是具有高度有序结构的一条伸展的链，同时也获得了关于分子部分的排列和大小方面的信息，很重要的是，DNA分子是双螺旋结构。 • 2、从许多生物中分离出DNA分子，对其A、T、G、C的摩尔含量进行了化学分析（也称碱基组成） [A]=[T]；[G]=[C]；[]为摩尔浓度 [A+G]=[T+C] • 3、Watson和Crick将X射线衍射图与DNA的化学与物理数据结合起来，得出常见的B型DNA双螺旋结构模型。

双螺旋模型要点(二级结构) • 1、两条主链彼此盘绕形成双股螺旋，糖-磷酸作为骨架位于外侧。 • 2、两条链反向平行，一条为3ˊ→5ˊ；另一条为5ˊ→3ˊ。 • 3、碱基在中央成螺旋排列，A=T；C=G。 • 4、每一碱基对的两个碱基位于同一平面，垂直于螺旋轴。 • 5、每个相邻的碱基对旋转36°，故每匝螺旋有10对碱基，每个碱基对之间的距离为0.34nm • 6、双螺旋直径为20Å • 7、单位长度的螺旋分子量约2×106/µm。 • 8、大沟与小沟是蛋白质分子与碱基相接触的地方。

DNA 类型碱基对/圈旋转度/碱基对螺距 nm 螺旋直径（nm）产生条件纤维状态在溶液中 A 11 +32.7 2.8 2.3 75% K+、Na+或Cs+ B 10 +36.0 3.4 2.0 92% 低盐 C 9.33 +38.6 3.1 1.9 66% - Z 12 -30.0 4.45 1.8 - 高盐表不同空间结构类型的DNA

DNA分子的结构特性 • 1.碱基配对的偶联性 • 2.碱基序列的重复性 • 1)单拷贝DNA碱基序列 • 2)中度重复的DNA碱基序列短分散片段：长300-500bp，被平均长1000 bp的单拷贝序列隔开。如人 ------ ------ ------ 300bp 1000bp 长分散片段：长>1000 bp，平均长度3500-5000 bp，常被13000 bp（有的更长）的单拷贝序列隔开。如果蝇 ------ ---------- 5600bp 13000bp

3）高度重复序列 反向重复序列： CBA ABC 回文结构：无间隔发夹结构：有间隔卫星DNA 一般只有几个碱基如果蝇： ⅰ、ACAACT ⅱ、ATAAACT ⅲ、ACAAATT 更复杂的DNA序列：具个体特异性，可能有以下功能 a）与复制、转录调控有关 b）与转位、转座有关 c）可能与进化有关 d）存在个体差异，可用于指纹分析。

3、碱基上基团的可变性 普通型稀有型 T 酮式醇式 C 氨基式亚氨基式 A 氨基式亚氨基式 G 酮式醇式 4、双链DNA的变性和复性 5、双链DNA的变构性 6、双链DNA分子中极性整体无极性，但每一条单链及核苷酸有极性，5ˊ 为P，3ˊ为-OH。这种极性与复制、转录、重组、特异酶的识别等有关。正常DNA △变性逐渐冷却复性

DNA分子的复制 1、DNA复制的基本特点 1）复制需要模板 2）半保留复制（见P98） 3）半不连续性复制：在双链DNA分子的复制中，一般认为以3ˊ→5ˊ模板链所复制的先导链是连续合成的，以5ˊ→3ˊ模板链所合成的后随链是不连续合成的，所以称整个双链DNA分子是半不连续性复制。岗崎片段（Okazaki fragment）：在DNA复制中，以5ˊ→3ˊ模板不连续合成的DNA片段。在原核生物每个冈崎片段一般含1000-2000个核苷酸，真核生物的冈崎片段长约100-200个核苷酸

复制叉的延伸 • 复制叉的单向延伸复制叉 • 复制叉双向延伸起点

4）DNA合成方向为5ˊ→3ˊ 5）需要引物（大多数情况下是RNA）。为什么？ 6）有特殊的起点 7）复制过程中可进行校正，保证其真实性。 8）复制过程同样受到调控 5ˊ 3ˊ 2、参与DNA复制过程的酶和蛋白质①螺旋酶（Helicase）促使DNA 在复制叉处打开双链，需要ATP Rep蛋白与前导链结合 Ⅱ或Ⅲ 与滞后链结合

②单链结合蛋白（SSBP）：又称双螺旋反稳定蛋白，其作用是与解链后的DNA单链结合，使其掩蔽的序列免遭Dnase降解，以保持复制模板的稳定。②单链结合蛋白（SSBP）：又称双螺旋反稳定蛋白，其作用是与解链后的DNA单链结合，使其掩蔽的序列免遭Dnase降解，以保持复制模板的稳定。 ③拓扑异构酶（DNA topoisomerase，Topo）能将单、双链的DNA分子进行拓扑变化的一种酶 TopoⅠ不需ATP，使超螺旋的环状DNA解旋成为不具有超螺旋的、松弛状态的环状DNA的酶。 TopoⅡ需ATP，能促使产生负超螺旋并消除复制叉移动所产生的正超螺旋，以利解链。

引物酶 RNA聚合酶雷米封不敏感底物既能利用RNA，也可利用DNA 只利用RNA （专一）时间作用只是在DNA复制时合成 RNA引物“引发” 启动DNA→RNA 起始、延伸 ④引物酶与RNA聚合酶

⑤DNA聚合酶（DNA polymerase） 也称DNA复制酶、依赖于DNA的DNA聚合酶。催化以DNA为模板，以dATP、dGTP、dCTP和dTTP四种dNTP为底物，按碱基配对原则，沿5′→3′方向合成DNA的酶，有的还参与复制错误校正和DNA损伤修复。催化反应需要某些蛋白因子、引物和Mg2+。酶Ⅰ（DNA polⅠ）：1956年，Arthur Kornberg发现，又称Kor-nberg酶。由一条1000aa残基组成，MW约109KD。 76KD 大片段又称Klenow片段，是在基因工程中常用的酶枯草杆菌蛋白酶 DNA polⅠ 34KD 小片段

DNA聚合酶主要功能： 聚合作用（5ˊ→3ˊ）； 3ˊ→5ˊ外切酶活性——校对作用； 5ˊ→3ˊ外切酶活性——切除修复作用

酶Ⅱ（DNA polⅡ）1970年发现，MW为120KD，活性只有酶Ⅰ的5% 主要活性： a、聚合作用 b、3ˊ→5ˊ外切酶活性，无5ˊ→3ˊ外切酶活性 c、对底物选择性很强 d、可能在损伤修复中起一定作用。酶Ⅲ（DNA polⅢ）MW420KD全酶至少含有10个亚基，其中α、ε和θ构成核心酶，而β、τ、δγ、χ、ψ为辅助亚基。该酶具有5ˊ→3ˊ聚合酶活性和5ˊ→3′、3′→5′外切校正活性，在复制叉上对前导链、滞后链均起合成延伸作用。

polⅠ polⅡ polⅢ 5′→3′聚合酶活性 3′→5′外切酶活性 5′→3′外切酶活性新生链合成分子量（KD）分子数/细胞转化率生物学活性编码的结构基因＋＋＋－ 109 400 ～600 1 polyA ＋＋－－ 120 100 ～30 O.O5 polyB ＋＋－＋ 420 10-20 ～9000 15 polyC（dnaE，N，Z，X，Q）表大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的性质比较

⑥DNA连接酶（DNA ligase） 1967年发现，用于封闭DNA链上的缺口，将单链DNA分子中相邻核苷酸的3′—OH与5′—P之间形成3′、5′—磷酸二酯键。条件： ①两条链必须是同一条互补链配对结合的 ②必须是两条紧邻的DNA链（缺口不能太大）

3、DNA的复制过程引发 延伸终止 ①复制起点（oric）原核生物的复制起点由422bp组成，其中245bp由重复序列组成，包括三个13bp的重复和四个9bp的重复 GATCTNTTNTTTTTTATNCANA （N为任何一个bp）

②复制起始例E.Coli DanA DanB DanC DnaA蛋白单体开始结合到9bp重复序列…20～40个DnaA形成聚合物，DNA开始在13bp处解链…DnaB/DnaC蛋白参与复合物，双向复制叉形成。

DNA 螺旋酶单链DNA 单链结合蛋白（SSBP ） DnaB、DnaC、x、y、n等6种蛋白引发前体引物酶引发体（火车头） DNA 复制过程：

概念： • 预引发是DNA复制中形成RNA引物的准备阶段 • 预引发体DNA复制起始时在模板链的复制起点处，由复制蛋白因子所构成的复合体 • 引发为DNA复制起始时合成RNA引物的过程 • 引发体由预引发体与引发酶结合所形成的一种复制起始复合物，以引发RNA引物的合成。 • 转录激活在DNA复制起始时，由RNA聚合酶通过转录过程在复制起点局部解开双链，并由引发酶和有关蛋白因子结合于解链后的单链上形成引发体，由引发酶催化产生的短链可作为合成先导链和后随链的引物，这个过程叫转录激活。见大肠杆菌ColEⅠ质粒DNA的复制。 • 问题：DNA复制为什么需要有RNA引物来引发？

SSBP Rep 螺旋酶 Ⅱ或Ⅲ 引发体 DNA pol Ⅲ TopoⅡ ③延伸

④DNA复制的终止 前导链或冈崎片段合成完成后，由RnaseH或DNApolⅠ的5′→3′外切酶除去RNA引物，留下的空隙由DNApolⅠ负责填补，最后由DNA连接酶封闭缺口，生成完整的DNA分子。

3′ 5′ 3′ 5′ 3′末端互补 DNApolⅠ、连接酶核酸酶切割末端冗余（terminai redundancy ） “多连体” 关于DNA末端复制 • 线性DNA末端的复制以T7DNA为例

两端形成发夹环状结构 例痘病毒

Nick a b c d e f C B A A B C D E F c b a a b A B C D E F c a b A B C f e d c

环状DNA的复制形式 （一）、θ型复制P101～102 （二）、滚环复制 ΦΧ174 单向复制

（三）、D—环复制（D—loop） 存在于线粒体和叶绿体，其特点是两条链复制不同步另外，还有不需要RNA引物的DNA复制；单链DNA的复制等，在此不再详述。

真核细胞DNA的复制 1、复制起点有多个如酵母的复制起点，称自主复制序列（autonomosly replication sequence，ARS），其序列是A/TTTTATRTTTA/T。每个基因组中总数约400个，使用频率在10%～100%之间。在使用时序上，一类是在S期的前期启动邻近序列的复制，另一类于S期的后期使用。将ARS与载体结合后插入适宜的寄主DNA，可诱导复制。

DNA聚合酶α DNA聚合酶β DNA聚合酶γ 相对分子量在细胞内分布功能相对活性亚基数 110～220 核内 DNA复制约80% 多个 45 核内 DNA损伤修复 10%～15% 1个 60 核和线粒体？ 2%～15% 1个 2、复制叉例SV40 参与复制的酶和蛋白质 A、DNA聚合酶 B、解旋酶打开DNA双螺旋

C、蛋白因子： RF-A或RP-A可与单链DNA或双链DNA结合，相当于原核生物DNA复制时的SSBP，起稳定单链区的作用； RF-C，像一夹子（clamp），将DNApolα和δ结合在一起增殖细胞核抗原（PCNA）：是DNApolδ的辅助因子。有它存在，前导链和滞后链同时合成，没有则只合成冈崎片段。

3、终止 端粒酶（telomerase）：一种依赖于RNA的DNA聚合酶（逆转录酶），是一种核酸蛋白复合体结构，能以酶本身的RNA成分上的一个片段（RNA核心）为模板合成端粒重复序列，为染色体的DNA末端加尾，或修补已断裂的染色体末端，维护基因组的遗传稳定性。它由RNA和蛋白质两种成分组成，最早于1985年在四膜虫中发现，最近研究表明，他可能在所有的真核生物细胞中都存在，而且具有相似的结构组成和功能。

以上过程重复多次可将多个5′TTGGGG 3′重复序列加在3′末端。端粒酶和一般DNA聚合酶的区别在于其是利用自己的RNA组分作为聚合DNA的模板，而DNA聚合酶则利用外源DNA 。

本章小结 1.DNA是主要的遗传物质：间接证据4个，直接证据3个。 2.核酸的化学结构：DNA的分子结构、双螺旋结构、自我复制。 3.染色体的分子结构：原核生物“染色体”结构模型；真核生物染色体的折叠模型。 4.DNA的复制：DNA的半保留复制；真核和原核的复制特点。 5.RNA的转录和加工：三种RNA分子；原核生物RNA的转录和加工。

第九章 遗传的分子基础