生物化学实验

1. 生物化学实验 任课教师：李遂焰

2. 实验一 总糖的测定——蒽酮比色法

3. 实验要求 • 掌握蒽酮比色定糖法的原理和方法 • 掌握72型分光光度计的原理和操作方法 • 学习通过制作标准曲线测定未知物含量的方法

4. 实验原理 • 糖类在较高温度下经浓无机酸作用脱水产生糠醛或糠醛衍生物，可与蒽酮缩合成蓝绿色化合物，颜色深浅与糖量成正比。 • 本法多用于测定糖原含量，也可用于测定葡萄糖含量。

5. 实验内容与结果 • 1、制作葡萄糖标准曲线 • 2、测定样品含糖量 • 计算100克小麦面粉中总糖含量

6. 实验二 氨基酸的分离鉴定——纸层析法

7. 实验要求 • 学习分配层析法的原理 • 掌握氨基酸纸上层析的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色及鉴定）

8. 实验原理 • 纸层析法是以滤纸作支持物，纸纤维上的羟基具有亲水性，能吸附一层水作固定相，而与水不相混合的有机溶剂作流动相，因此利用分配层析原理，不同物质在两相间有不同的分配系数而在纸上移动的距离不同，即被分开。 • 本实验分离的是混合氨基酸样品，层析之后用茚三酮试剂显色。

9. 实验内容与结果 • 1、点样 • 2、展层 • 3、显色 • 用铅笔描出显色斑点的形状，测其距离并计算各氨基酸的Rf 值。

10. 实验三 蛋白质的等电点测定及沉淀反应

11. 实验要求 • 了解蛋白质的两性解离性质 • 学习测定蛋白质等电点的一种方法 • 通过实验加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 • 区分可逆沉淀反应及不可逆沉淀反应并了解其实用意义 • 了解蛋白质变性及沉淀的关系

12. 一、蛋白质的等电点测定 • 原理： • 蛋白质是两性电解质，其解离状态和程度受溶液的酸碱度影响。在等电点（pI）时，蛋白质的理化性质有变化，可利用性质的变化测定蛋白质pI。常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。 • 操作： • 用醋酸和醋酸钠配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。

13. 二、蛋白质的沉淀反应 • 原理： • 蛋白质是一类高分子化合物，分子大小已达胶体颗粒范围（1~100毫微米）,因此蛋白质在水溶液中具有胶体的性质。维持蛋白质胶体稳定的因素有两个：一是胶体颗粒所带的电荷，一是与介质水形成的水化膜。这种稳定性是有条件的、相对的，在一定物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。 • 蛋白质的沉淀反应可分为两类： • 1）可逆沉淀反应：如盐析作用，等电点沉淀蛋白质等。提纯蛋白质时，常用此类反应。 • 2）不可逆沉淀反应：如重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀而析出。

14. 操作 • 1．蛋白质的盐析作用 • 2．重金属沉淀蛋白质 • 3．有机酸沉淀蛋白质 • 4．有机溶剂沉淀蛋白质 • 5．生物碱试剂沉淀蛋白质

15. 实验四 血清γ—球蛋白的分离、纯化及鉴定

16. 实验要求 • 初步学会分离、纯化蛋白质的常用方法并了解其原理。 • 学习盐析、层析基本原理及实验技术。 • 掌握电泳基本原理，熟悉操作方法，了解影响电泳的因素。

17. 实验原理 • （一）血清γ—球蛋白的分离 • 血清蛋白质先用盐析初步分离。半饱和硫酸铵可沉淀血清球蛋白而白蛋白不被沉淀，离心后白蛋白主要集中在上清液中，而球蛋白主要在沉淀中。将球蛋白沉淀溶于少量水中，装于透析袋，透析除去硫酸铵。脱盐后的蛋白质溶液，在0.0175摩尔/升pH6.3磷酸缓冲液条件下加到DEAE—纤维素柱上，在此pH下，DEAE—纤维素带正电荷，能吸附带负电荷的白蛋白、α-及β-球蛋白，仅γ—球蛋白不能吸附而直接流出。

18. (二) 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳 • 利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化剂、加速剂的作用下发生聚合反应而制得的，利用电泳和分子筛的双重作用分离物质，分辨力较高。血清蛋白在纸上电泳可分为5~7个组分，而在聚丙烯酰胺电泳上可分出12~25个组分。

19. 实验内容 • （一）血清γ—球蛋白的分离纯化 • 1．硫酸铵盐析 ：注意应缓慢滴入饱和硫酸铵溶液并边加边摇，避免局部浓度过高。 • 2．透析脱盐：用纳氏试剂检查水中NH4+，直至硫酸铵全部透析完毕。 • 3．DEAE—纤维素柱层析：装柱、平衡柱床、上样、洗脱收集。 • 4．检查洗脱液中蛋白质：磺基水杨酸检查，出现白色沉淀即有蛋白质析出。合并蛋白质含量高的洗脱液，以备鉴定。

20. （二）血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳 • 1．凝胶板的制备：板状电泳槽按要求夹好、固定，用1%琼脂封边，并按比例配制凝胶，灌入凝胶板。 • 2．样品的准备：样品中加入样品稀释液，内含溴酚兰为示踪染料。 • 3．电泳：将上电泳槽的电极接电泳仪的负极，下电泳槽接正极，调节电压为150伏，电泳约1小时。 • 4．剥胶 • 5．固定、染色、脱色

21. 实 验 结 果 • 将分离纯化的蛋白质收集，经电泳分离并与标准蛋白质作对照，绘出电泳图谱。

22. 实 验 五 维 生 素 C 的 定 量 测 定 ——2，6-二 氯 酚 靛 酚 法

23. 实验要求 • 学习定量测定维生素C的原理和方法。 • 掌握微量滴定法的基本操作技术。

24. 实 验 原 理 • 维生素C又名抗坏血酸，是水溶性维生素，具有很强的还原性，在碱性和微酸性环境中，能还原2，6-二氯酚靛酚成无色的还原型2，6-二氯酚靛酚，同时自身被氧化成脱氢抗坏血酸。 • 氧化型的2，6-二氯酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色，当用2，6-二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸尚未全部被氧化时，滴下的2，6-二氯酚靛酚立即呈现无色，当溶液从无色转变成微红色时，即表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点，可以算出被检物质中抗坏血酸的含量。

25. 实验内容与结果 • 1、提取维生素C • 2、用2，6-二氯酚靛酚钠溶液滴定标准维生素C，计算1毫升2，6—二氯酚靛酚溶液相当于抗坏血酸多少毫克。 • 3、用2，6-二氯酚靛酚钠溶液滴定样品维生素C，计算100克样品所含维生素C的毫克数。 • 4、注意事项：滴定过程必须迅速 。

26. 实 验 六 肝脏碱性磷酸酶的提取及活力测定

27. 实验要求 • 学习和掌握有机溶剂沉淀法提取碱性磷酸酶的原理和实验技术。 • 掌握以磷酸苯二钠为底物测定碱性磷酸酶活力的原理和方法。

28. 实 验 原 理 • 碱性磷酸酶（Alkaline plosphatase,简称AKP或ALP）是磷酸酶中的一种，广泛存在于生物体中，参与物质的代谢调节。本实验采用有机溶剂分步沉淀法提取AKP，即利用样品中各种不同的成分在不同的有机溶剂中溶解度不同，反复进行沉淀、溶解而达到分离纯化的目的。

29. 酶分离纯化后需测定活力。比活性是指单位重量的酶蛋白样品中所含的酶活性单位，随着酶蛋白逐步纯化，其比活性将随之升高，因此测定酶的比活性可鉴定酶的纯化程度。酶分离纯化后需测定活力。比活性是指单位重量的酶蛋白样品中所含的酶活性单位，随着酶蛋白逐步纯化，其比活性将随之升高，因此测定酶的比活性可鉴定酶的纯化程度。 • AKP属水解酶，在碱性条件下（pH9～10）能水解多种磷酸酯。以磷酸苯二钠作为酶的底物，水解产生的酚与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化可产生红色醌类衍生物，根据红色深浅通过分光度法测定酶活性。 • AKP蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。考马斯亮蓝能与蛋白质结合生成蓝色复合物，在一定浓度范围内，蛋白质含量与颜色深浅成正比。

30. 实验内容与结果 • （一）AKP的提取 • 匀浆 → 抽提 → 丙酮、乙醇反复沉淀 → AKP纯酶液 • 注意事项： • 所用有机试剂必须预先预冷。 • 提取过程中所有有机试剂浓度应计算准确，加量准确。 • 各阶段提取液需取出部分待测比活性。

31. （二）AKP比活性测定 • 1、样品酶活性测定： • 酶活性单位计算：在37℃下保温15分钟产生1毫克酚，称为该酶的1个活性单位（U）。 • 计算每毫升酶液的酶活性单位（U/mL） • 2、样品酶蛋白含量测定： • 计算每毫升酶液的蛋白含量（mg/ml） • 3、比活性计算： • 比活性（ U/mg）=每毫升酶液的酶活性单位/每毫升酶液的蛋白含量 • 4、注意事项： • 注意各阶段的稀释倍数及取样量。 • 各管加样量要准确，注意反应时间。

32. 实 验 七 碱性磷酸酶酶促反应动力学实验

33. 实验要求 • 了解酶促反应动力学的研究内容及意义 • 通过检测不同温度条件下AKP的活性，了解温度对酶活性的影响 • 学习测定酶最适pH的方法，了解pH对酶活性的影响 • 了解底物浓度对酶促反应速度的影响，学习测定米氏常数（Km）的原理和方法。

34. 实 验 原 理 • 酶促反应动力学是研究酶促反应速度以及影响此速度的各种因素的科学，如底物浓度、酶浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等，进行酶促反应动力学研究具有重要的理论和实践意义。 • 酶的催化作用受温度的影响。当温度达到某一定值时，酶促反应达到最高峰，此温度称为酶的最适温度。

35. 酶的活力受环境pH的影响极为显著。通常只有在一定的pH范围内，酶才表现其催化活性，且在某一pH时，酶的活性才达最大值，称为最适pH值，不同酶的最适pH值不同。酶的活力受环境pH的影响极为显著。通常只有在一定的pH范围内，酶才表现其催化活性，且在某一pH时，酶的活性才达最大值，称为最适pH值，不同酶的最适pH值不同。 • 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应速度（V）随底物浓度（[S]）的增加而迅速增加；但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小；当底物浓度增加至某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vm）。 • Km值是酶的一个特征常数，是反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。Km可以近似表示酶与底物的亲和力，测定Km是酶学研究的一个重要方法。

36. 实验内容 • 1、温度对酶活性的影响 • 2、pH对酶活性的影响 • 3、底物浓度对酶活性的影响（Km的测定）

37. 实验结果 • 1、比较各种温度对AKP酶活性的影响，确定其最适温度。 • 2、比较各种pH对AKP酶活性的影响，确定其最适pH值。 • 3、以酶活性单位代表各管中酶反应速度(v)作纵坐标，以底物浓度（[s]）为横坐标，连接各点，观察该图形的形状。 • 以酶活性单位的倒数（1/v）为纵坐标，底物浓度的倒数（1/[s]）为横坐标，在坐标纸描出各点并连接，求该酶的Km值。

38. 实 验 八 胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响

39. 实验要求 • 了解胰岛素及肾上腺素调节机体血糖浓度的机理与效果 • 学会制备无蛋白血滤液 • 掌握磷钼酸比色法测定血糖的原理和方法

40. 实 验 原 理 • 人和动物体内，血糖浓度受各种激素调节而维持恒定。胰岛素促进肝脏和肌肉将葡萄糖合成糖原，又加强糖的氧化作用，故可以降低血糖；肾上腺素促进肝糖原分解而增高血糖。 • 葡萄糖的醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热后，被氧化成羧基，而碱性铜试剂中的二价铜则被还原成砖红色的氧化亚铜沉淀，氧化亚铜又可使磷钼酸还原生成钼蓝，使溶液呈蓝色，其蓝色深浅与葡萄糖的浓度成正比。

41. 实验内容与结果 • 1、激素的作用： • 动物准备 →取空腹血→注射激素后取血 • 2、血糖的测定： • 无蛋白血滤液的制备 • 测定血糖 • 计算：样品的血糖含量(毫克%) • 注意事项： • 血糖测定反应在取血后2小时内完成，放置过久，糖易分解，使含量减低。 • 磷钼酸试剂宜贮于棕色瓶中，如出现蓝色，表明试剂本身已被还原，不能用。 • 碱性铜试剂中有氧化亚铜沉淀，也不能用。

42. 实 验 九 肝 细 胞 DNA 的 制 备及 含 量 测 定

43. 实验要求 • 学习和掌握浓盐法从肝细胞中提取DNA的原理操作技术 • 学习紫外分光光度计测定DNA含量的原理和操作方法 • 熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法 • 学习定糖法（二苯胺法）测定DNA含量的原理和操作技术

44. 实 验 原 理 • DNA的制备： • DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的。动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1摩尔/升氯化钠），但在0.14M盐溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）则溶于稀盐溶液,利用这一性质可将DNP与RNP以及其他杂质分开。 • 分离得到DNP之后，必须将其中蛋白质除去。用十二烷基硫酸钠（SDS）处理，使DNA与蛋白质分开，然后用氯仿-异戊醇乳化蛋白质，离心除去变性蛋白质，再用乙醇抽提DNA。

45. DNA含量测定： • DNA具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在260毫微米波长处。核酸的消光系数（或吸收系数）用ε(p)表示，即每升含有一克原子核酸磷的光吸收值（即A值），因此，用紫外分光法测定核酸含量时规定：在260毫微米波长下，每毫升含1微克DNA溶液的消光值（即O.D.260）为0.020,而每毫升含1微克RNA溶液的O.D.260值为0.022,故测定未知浓度DNA溶液的O.D.260，即可计算出DNA的含量。 • DNA被酸水解后生成的脱氧核糖可以与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595毫微米处有最大吸收。DNA在40~400微克范围内，光密度与DNA浓度成正比。

46. 实验内容与结果 • 1、DNA的制备： • 肝脏匀浆→离心→正丁醇脱脂→SDS使DNP中DNA游离→氯仿-异戊醇使蛋白质变性和溶解脂类→离心→乙醇沉淀DNA →无水乙醇反复DNA • 注意事项： • 匀浆程度和次数需严格限制。匀浆目的是破坏细胞膜，避免破坏细胞核。 • 必须加入足够量的SDS。 • 搅拌应小心，缓慢，避免将DNA丝状物打断。

47. 2、DNA含量测定： 紫外吸收法 二苯胺显色法 计算DNA的含量

48. 实验十 细胞核的分离和鉴定

49. 实验要求 • 了解亚细胞结构分离的原理和方法 • 熟悉分离细胞核的方法，学习并掌握柠檬酸法分离细胞核的操作技术 • 运用光学显微镜观察细胞核的形态

50. 实验原理 • 为研究细胞核及其组成成分，如染色质、DNA及核内小分子RNA等，需要分离制备细胞核。在分离时应注意保持细胞核形态上的完整性，核内成分不渗漏，不污染细胞质等其他细胞器，并有较高的得率。 • 实验室常用的方法有：有机溶剂法、高密度介质离心法。 • 本实验采用柠檬酸水溶液法：将组织在一定浓度的柠檬酸溶液中匀浆，通过差速离心，把比重较大的细胞核从细胞质成分和组织碎片的悬浮液中沉淀下来，然后通过蔗糖梯度离心，除去吸附于核膜上的细胞质颗粒物质，获得纯净的细胞核。运用光学显微镜或电子显微镜观察细胞核形态。