固相萃取（ SPE ）技术

1. 固相萃取（SPE）技术 厦门大学环境科学研究中心 陈 猛 2005年12月22日

2. 固相萃取技术SPE • 一. 概述 • 二. SPE基本原理 • 三. SPE法的优点 • 四. SPE装置 • 五. SPE的类型 • 六. SPE方法的建立 • 七. SPE的应用

3. 一.概述 所谓萃取法 ,就是从样品中提取组分 ,传统的方法是液液萃取法 ( LLE) ,即用液体作为提取剂 ;我们这里探讨的SPE ,是用固体物质作为萃取剂 ,采用高效、高选择性的固定相 进行萃取的样品预处理技术。 SPE技术自上世纪70年代后期问世以来，发展迅速，广泛应用于环境、制药、临床医学、食品等领域 。

4. 一.概述 借助SPE所要达到的目的是： （1）从试样中除去对以后的分析有干扰物质；（2）富集痕量组分，提高分析灵敏度； （3）变换试样溶剂，使之与分析方法想匹配； （4）原位衍生； （5）试样脱盐。 使用SPE方法，要尽可能避免柱因超载而被穿透，从而影响分析结果的准确性 。

5. 概述 样品类型 SPE可以用于所有类型样品的处理，但是液体样品是最容易处理的。 Survey response %

6. 二.SPE基本原理 SPE是一种吸附剂萃取，样品通过填充吸附剂的一次性萃取柱，分析物和杂质被保留在柱上，然后分别用选择性溶剂去除杂质，洗脱出分析物，从而达到分离的目的。 SPE的分离模式主要取决于填充剂的类型和溶剂的性质。

7. 二.SPE基本原理 SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、固定相和溶剂的选择等方面与高效液相色谱（HPLC）有许多相似之处。 但是SPE柱的填料粒径（>40µm）要比HPLC填料（3~10µm）大。由于短的柱床和大的粒径，SPE柱效比HPLC色谱柱低得多。 因此，用SPE只能分开保留性质有很大差别的化合物。 与HPLC的另一个差别是SPE柱是一次性使用。

8. 三.SPE法的优点 • (1 ) 简单、快速和简化了样品预处理操作步骤 ,缩短了预处理时间。 • (2 ) 处理过的样品易于贮藏、运输 ,便于实验室间进行质控。 • (3 ) 可选择不同类型的吸附剂和有机溶剂用以处理各种不同类的有机污染物。 • (4) 不出现乳化现象 ,提高了分离效率。 • (5) 仅用少量的有机溶剂 ,降低了成本。 • (6) 易于与其他仪器联用 ,实现自动化在线分析。

9. 四. SPE装置 "Shrink-wrapped" polypropylene Sorbent bed Cleaned polyethylene frits Luer tip

10. 五. SPE的类型 在SPE法中最常用的吸附剂是硅胶或键合相的硅胶即在硅胶表面的硅醇基团上键合不同的有机基团，如烷基链或其它官能团，如-OH、-C6H5、-NH2、-CN等。实际上吸附剂角色是由这些新接上的含官能基碳链来完成。 以硅胶为基质的吸附剂主要有以下优点： 粒径（e.g.40µm)、孔径（ e.g.60A）、表面积（600m2/g)、键合量易控制；机械强度高；化学性质稳定；适应性广；可使用的溶剂种类多。

12. 五. SPE的类型 硅胶表面的官能团 OH Free silanol Si OH Geminal silanol Si Adsorbed water Si OH OH OH 2 Si Siloxane bridge (dehydrated silanol) Si O Bound and reactive silanols O O H Si Si O H

13. 五. SPE的类型 依据柱中填料（吸附剂）来划分，可将SPE法分为吸附型和键合相分配型（BPC）。 吸附型SPE是采用极性较强的硅胶、硅藻土和氧化铝等吸附剂，样品进入柱中，分析物的极性官能团先迅速被吸附至极性吸附剂上，而后以低极性溶剂转至中极性溶剂陆续洗去杂质及洗脱出分析物。

14. 五.SPE的类型 以硅胶为基质的固定相的分类 NON-POLAR PHASES POLAR PHASES C18 Octadecyl CN Cyanopropyl C2 Ethyl 2OH Diol Increasing polarity CH Cyclohexyl NH2 Aminopropyl PH Phenyl SI Silica SPECIALTY PHASES ION-EXCHANGE PHASES Strong cation exchanger PBA SCX CERTIFY CBA Weak cation exchanger ENVIRELUT SAX Strong anion exchanger ACCUCAT NH2 Weak anion exchanger

15. 五. SPE的类型 硅胶键合非极性固定相 填充剂使用非极性烷烃类化学键合相 （C18、C8、C6H5-C6H11等）的SPE分离方式称为反相BPC。最适用于极性基质中萃取非极性化合物。 当样品溶液通过萃取柱时，杂质不被保留，直接通过柱子除去，只有分析物保留在柱上，只要选用一种合适的洗脱溶剂既可将其从柱上洗下。

17. 五. SPE的类型 分析物与非极性固定相的作用力 NH2 SO3- Silica base Bonded functional group (C8) Van der Waals forces

18. 五. SPE的类型 硅胶键合极性固定相 填充剂使用极性键合固定相（-NH2、-CN、-2OH等官能团）的SPE分离方式称为正相BPC。 其对极性分析物的吸附力不及分配型SPE大，故洗脱容易。在实际使用中，先以非极性溶剂清洗管柱，继而加样，分析物立刻会被吸附，然后以非极性溶剂洗去杂质，最后以极性溶剂洗脱分析物。

20. 五. SPE的类型 分析物与极性固定相的作用力 Silica base H O O OH O H H O C N Dipolar attraction or hydrogen bonding

21. 五. SPE的类型硅胶键合离子交换剂 填充剂为硅胶基质的离子交换官能团有：季胺、氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基等。 此外常用的还有聚合物，如苯乙烯-而乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等。相对于键合相填料，聚合物可适用于全部pH范围，因而应用广泛。 对于酸性化合物，如有机酸、无机阴离子、酸性蛋白等，一般采用阴离子交换SPE柱； 对于碱性化合物，如有机胺、金属离子、儿茶酚胺和碱性蛋白等，采用阳离子交换SPE柱。

23. SO3- SO3- CO2H N+Me3 NH2 硅胶键合离子交换剂 Weak or Strong Acids/Bases SCX PRS CBA SAX PSA NH2 Strong anion Strong anion, pKa <1 Weak anion, pKa 4.8 Strong cation Weak cation, pKa 10.9, 10.1 Weak cation, pKa 9.8 0.7meq/g 0.3meq/g pH-sensitive 0.8meq/g pH-sensitive pH-sensitive NHCH2CH2NH2

24. 五.SPE的类型 分析物与离子交换剂的作用力 OH Silica base NH3+ SO3- CO2H +N CO2- OCON(CH3)2 Electrostatic attraction

25. Matrix type Saline solution Olive oil Drinking water Compound NH2 NH2 NH3+ 基体对选择合适分离机制有着重要影响（e.g.) Suggested mechanism Non-polar Polar Ion exchange

26. 五. SPE的类型 混合模式固定相

28. 六. SPE方法的建立 SPE操作步骤包括有柱子类型的选择、柱预处理、加样、洗去干扰物和回收分析物四个步骤。 在加样和洗去干扰物步骤中，部分分析物有可能穿透SPE柱造成损失，而在回收分析物步骤中，分析物可能不被完全洗脱，仍有部分残留在柱上。最理想的情况是分析物100%地回收到收集的组分中，但这并不是总能达到的。

29. SPE柱子类型的选择

32. 1、Reversed-phase bonded silica sorbents having alkyl groups such as octadecyl (C18, C18), octyl (C8, C8), or ethyl (C2, C2) covalently bonded to the silica gel backbone or cyclohexyl (CH) or phenyl groups and sorbents composed of polymeric resins such as polystyrene–divinylbenzeneinteract primarily with analytes via van der Waals forces. 2、Nonionic watersoluble compounds can be retained by reversed-phase sorbents but may not be as well retained as analytes that are soluble in methanol or methanol–water miscible mixtures. 3、Normal-phase polar sorbents, such as silica, alumina, and Florisil, and cyano (CN) bonded phases interact by polar-dipole/dipole forces between polar functional groups in the analyte and the polar surface of the sorbent. 4、Amino (NH2) and diol sorbents interact with analytes by hydrogen bonding. 5、Hexane-soluble analytes are best retained by normalphase sorbents such as silica or Florisil or polar functionally substituted bonded phases such as amino or diol. 6、Strong cation-exchange (SCX) and strong anion-exchange (SAX) sorbents interact primarily through electrostatic attractions between the sorbent and the analyte. 7、Graphitized carbon sorbents exhibit both nonspecific van der Waals interactions and anionexchange, or electrostatic, attraction for analytes.

33. 1、Dependence of Sorption on Sample pH If a compound is ionizable, the extraction will be pH dependent. Monomethyl (MMP), Monoethyl (MEP), Mono-n-propyl (MPRP), Mono-n-butyl (MBP), Mono-n-pentyl (MPEP), Mono-n-octyl (MOP) Phthalates（邻苯二甲酸盐酯）

34. 2、Dependence of Sorption on Sample Volume Breakthrough volume as the point at which 1% of the sample concentration at the entrance of the sorbent bed is detected at the outlet of the sorbent bed. The type and quantity of sorbent, hydrophobicity and ionizability of the analytes, and sample volume and pH interactively determine the breakthrough volume. The breakthrough volume for a specific mass of sorbent can be established by either loading variable-volume samples of constant concentration or variable-volume samples of variable concentration, in which case the latter comprises a constant molar amount loaded 。Alternatively, methods exist for predicting the breakthrough volume.

35. 六. SPE方法的建立柱预处理-Condition 柱预处理有两个目的:一个目的是除去填料中可能存在的杂质；另一个目的是使填料溶剂化，提高固相萃取的重现性。填料未经预处理或者未被溶剂湿润，能引起溶质过早穿透，影响回收率。 对于非极性相和离子交换SPE柱使用的柱预处理溶剂为易溶于水的甲醇、 乙腈、四氢呋喃和丙酮。通常还要用水或缓冲液洗去残留在柱上的有机溶剂。

36. 六. SPE方法的建立柱预处理-Condition 对于极性的SPE柱，非极性溶剂适合用于预处理过程 。通常很少有人用极性溶剂去处理极性的SPE柱，因为极性溶剂会与键合相发生作用 ，减少吸附剂的与样品作用的表面积。

37. 六. SPE方法的建立柱预处理– Why Condition？ Good transport between sample and sorbent Conditioned sorbent Unconditioned sorbent

38. 六. SPE方法的建立加样- Load Sample 预处理后，试样溶液被加至并通过SPE柱。在该步骤，分析物及杂质被保留在吸附剂上。 为了防止分析物的流失，试样溶剂强度不宜过 高。当以反相机理萃取时，以水或缓冲剂作为溶剂，其中有机溶剂量不超过10%（V/V）。为克服加样过程中分析物流失，可采用弱溶剂稀释试样、减少试样体积、增加SPE柱中的填料量和选择对分析物有较强保留的吸附剂等手段。

39. 六. SPE方法的建立除去干扰杂质-Wash 用中等强度的溶剂，将干扰组分洗脱下来，同时保持分析物仍留在柱上。对反相萃取柱，清洗溶剂是含适当浓度有机溶剂的水或缓冲溶液。通过调节清洗溶剂的强度和体积，尽可能多地除去能被洗脱的杂质。 为了决定最佳清洗溶剂的浓度和体积，加试样于SPE柱上，用5~10倍柱床体积的溶剂清洗，依次收集和分析流出液，得到清洗溶剂对分析物洗脱廓形。增加清洗溶剂强度，根据不同强度下分析物的洗脱廓形，决定清洗溶剂合适的强度和体积。

40. 六. SPE方法的建立分析物的洗脱和收集-Elution 这一步骤的目的是将分析物完全洗脱并收集在最小体积的组分中，同时使比分析物更强保留的杂质尽可能多地仍留在SPE柱上。 洗脱溶剂的强度是至关重要的。较强的溶剂能够使分析物洗脱并收集在一个小体积的级分中，但有较多的强保留杂质同时被洗脱下来。当用较弱的溶剂洗脱，分析物级分的体积较大，但含较少的杂质。为了提高分析物的浓度或要进行溶剂转换，可以把收集到的分析物级分用氮气吹干，再溶于小体积适当的溶剂中。

41. 六. SPE方法的建立 Sample matrix Wash solvent Elution solvent Retention Rinsing Elution

42. 六. SPE方法的建立 从SPE的操作步骤可以看出，SPE的重现性受多个因素的影响，实验条件是影响重现性的主要原因。提高重现性的方法有 （1）使用替代物，加入适当的替代物做参比； （2）加入样品量适当，不超出穿透量和穿透体积； （3）选择合适的洗涤液和洗脱液，确保分析物在操作中不流失。

43. 七. SPE的应用 非极性SPE柱 O Vitamin K1 from Serum using C8 3 O Surrogate, vitamin K1(25), contains additional 1-methyl butyl group

44. 七. SPE的应用 非极性SPE柱 • Condition: 2.0mL MeOH, 1.0mL H2O • Load Sample: 50mL serum, 30mL I.S., 1mL H20 • Wash: 2×1.0mL H20, dry under vacuum for 1 minute • Elute: HPLC mobile phase - AcCN/IPA/DCM (7:1:2 v/v) 2×150mL • SPE柱: C8柱 选择C8是因为维生素K1是亲脂性的 ，并且比C18柱更易于洗脱下来，洗脱之前一定要除去柱上的水分。 • 分析仪器：HPLC-DAD 检测器

45. 七. SPE的应用 极性SPE柱 Class Fractionation of a Lipid Mixture on NH2 Sorbent Cholesterol胆固醇 cholesteryl ester胆甾醇酯 Triglyceride甘油三酸酯 Diglyceride甘油二酯 Monoglyceride甘油一酸酯 free fatty acid 脂肪酸 Phospholipid磷脂 HO

46. 七. SPE的应用 极性SPE柱 • Sample pre-treatment: Plasma lipids were extracted and dried, then reconstituted in CHCl3. • Method development started from consideration of lipid structure (possible anion exchange, H-bonding, dipolar and non-polar interactions. TLC data provided indication on suitable sorbent types for screening. Solubility data was also used to devise suitable wash/elution solvent trials.

47. 七. SPE的应用 极性SPE柱 • Solvent typePLipid class eluted A 2:1 CHCl3/IPA4.07All neutral lipids B 2% AcOH in EtOEt 2.86Fatty acids C MeOH5.10All phospholipids D Hexane0.01Cholesteryl esters E 1% EtOEt/10% 0.44Triglycerides DCM in hexane F 5% EtOAc in hexane 0.32Cholesterol G 15% EtOAc in hexane 0.62Diglycerides H 1:1 CHCl3/MeOH4.43 Monoglycerides

48. 七. SPE的应用 极性SPE柱 A B C D A three cartridge sequence that permits best separation C, TG FA PL DG PL MG D C, CE FA PL CE TG, DG, MG C, TG DG MG CE

49. G H MG DG MG 七. SPE的应用 极性SPE柱 E F Stack cartridges DG DG MG MG C F Separate C after extraction C Combine extracts C TG

50. 七.SPE的应用离子交换柱 Extraction of Homovanillic Acid（3-甲氧 基-4-羟基苯乙酸/高香草酸） from Plasma HO COOH MeO Initial clean-up on C8， Secondary clean-up and analysis concentration on SAX before HPLC/ECD