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PCR 技术

PCR 技术. 广州体院运动生化重点实验室 黄丽英 2003.3. PCR实验技术. 第一部分 PCR技术理论基础. 一、 PCR 技术的发明 聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction， 简称 PCR） 1985年，美国 Cetus 公司人类遗传研究室的年轻科学家 Kary. B. Mullis 发明了 PCR 技术，1993年获诺贝尔化学奖。. 二、 PCR 反应原理. PCR 是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的 DNA 得以迅速扩增。.

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Presentation Transcript

  1. PCR技术 广州体院运动生化重点实验室 黄丽英 2003.3.

  2. PCR实验技术

  3. 第一部分 PCR技术理论基础 • 一、PCR技术的发明 • 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR） • 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的年轻科学家Kary. B. Mullis发明了PCR技术，1993年获诺贝尔化学奖。

  4. 二、PCR反应原理 • PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。

  5. （一） 变性DNA双螺旋结构的生物功能在于复制与 转录，加热或在碱性条件下可以使DNA双螺旋的氢键 断裂，形成单链DNA，称之为DNA变性。 （二） 退火 PCR反应体系的退火其实是模板与引物的 复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。 （三） 延伸PCR中链的延伸是有方向的，以引物为 起点，从5’端到3’端延伸，这是由DNA聚合酶（Taq酶） 决定的。

  6. DNA双螺旋结构

  7. PCR反应过程

  8. 利用PCR扩增基因

  9. 三、影响PCR的因素 • 1、模板 • 2、引物浓度 • 3、Mg2﹢浓度 • 4、DNA聚合酶用量 • 5、dNTP浓度 • 6、循环参数

  10. 四、PCR扩增的类型 • 1、RT-PCR； • 2、巢式（套式）PCR； • 3、复合PCR； • 4、原位PCR • 5、定量PCR； • 6、不对称PCR； • 7、单链构象型多态性PCR(PCR-SSCP)； • 8、酶联免疫分析(PCR-EIA)； • 9、免疫-PCR(Imuno-PCR); • 10、随机引物PCR(AP-PCR)(RAPD-PCR); • 11、限制性片段长度多态性PCR(PFLP-CPCR);

  11. 五、PCR技术的特点 • 优点：高特异性、高敏感性及简便快捷。 • 缺点：出现假阳性结果。

  12. 六、PCR技术的应用 • （一）PCR被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒、病菌感染。 • （二）在法医上，ＰＣＲ目前已成为发现罪证的重要方法。 • （三）利用ＰＣＲ技术，科学家们已从林肯的头发和血液、埃及的木乃伊、琥珀中八千万年前的昆虫、恐龙的骨头等不寻常的样品中提取了足够的ＤＮＡ进行研究。

  13. 第二部分：实验操作逆转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）第二部分：实验操作逆转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR） • 一、 实验目的 • 掌握PCR技术的基本原理，学会RT-PCR技术的操作和产物分析。 • 二、 实验原理 • RT-PCR中的模板是来源于RNA分子（如总RNA,m RNA,tRNA, rRNA,病毒RNA等）,但在作PCR扩增之前，需要用逆转录酶将RNA转化为cDNA 。PCR扩增同上。

  14. 逆向转录制备双链cDNA Oligo(dt)n mRNA cDNA SS-cDNA DS-cDNA (含Loop) DS-cDNA

  15. 材料 • 1、模板RNA • 2、逆转录酶 • 3、DNA聚合酶 • 4、引物 • 5、四种脱氧核苷酸混合物(dNTP)

  16. 实验步骤 • （一）组织RNA抽提： • 1、常规的异氰酸胍/酚/氯仿一步法 • 2、采用试剂盒（safe-kitRNA）抽提

  17. RNA抽提主要步骤 • 1、RNA提取： • 组织10-100mg 1mlTrizol 0.2ml氯仿 • 2、沉淀： • 0.5ml异丙醇 • 3、洗涤： • 75%（或以上）

  18. (二)RNA的检测 • 1、RNA浓度及纯度检测（核酸蛋白检测仪） • 灭菌水90µl+1µl RNA抽提液（即稀释100倍），260/280比值介于1.8—2.0之间,纯度符合要求。 • 2、电泳法鉴定RNA分子的完整性 • 0.8%的琼脂糖凝胶电泳，鉴定：28S荧光亮度约为18S的2倍，且无其它大分子条带，表明总RNA无蛋白污染、无降解。

  19. 心肌RNA电泳 28S 18S 5S

  20. PCR反应产物的检测 • 1、琼脂凝胶制作（1.5%琼脂糖） • （1）称取琼脂300mg • （2）量取0.5×TBE工作液20ml，加热溶解琼脂+溴化乙锭20ul • （3）封胶板及倒胶 • 2、上样：5µl+3µl溴酚兰加样液 • 3、电泳：在85V恒压下电泳50分钟。

  21. 凝胶成像分析系统处理 • 1．拍照 • 2．图像分析

  22. M C E CF EF 290bp 703bp

  23. 请到二楼“分子生物学实验室”

  24. DNA双螺旋结构

  25. DNA的单链骨架

  26. DNA的四种碱基相互配对

  27. 二 遗传信息的流动 • 分子遗传学中心法则(Central Dogma) • 复制 DNA RNA蛋白质 • 转录 翻译

  28. 中心法则的修正 • 反转录 复制 • 复制 DNA RNA蛋白质 • 转录 翻译

  29. 遗传信息传递的中心法则

  30. RNA的单链骨架

  31. RNA单链结构

  32. （1）rRNA基因家族 • rRNA基因: 28S, 18S,5.8S, 和5S. • 28S, 18S,5.8S, rRNA基因串联排列,组成一个转录单位, 5S rRNA基因单独构成一个转录单位,两个转录单位的转录方向相反. • 重复次数一般为几百次, 各种生物有差别.

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