南京农业大学生命科学学院

南京农业大学生命科学学院 生物化学技术原理及应用

第六章层析技术 • 层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的形状和大小、分子极性等）的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。南京农业大学生命科学学院

第六章层析技术 本章内容： • 第一节概述 • 第二节吸附层析 • 第三节分配层析 • 第四节凝胶过滤层析 • 第五节离子交换层析 • 第六节亲和层析 • 第七节聚焦层析 • 第八节薄层层析 • 第九节气相色谱 • 第十节高效液相色谱南京农业大学生命科学学院

第一节概述 • 层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 • 自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快。1950年以来，相继出现了气相层析，高压液相层析，薄层层析，薄膜层析，亲和层析，凝胶层析等。 • 层析技术操作简便，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产，还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。南京农业大学生命科学学院

第一节概述 • 基本原理： • 层析系统都由两个相组成： • 固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 • 流动相，即可以流动的物质。在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。南京农业大学生命科学学院

基本原理： • 当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。南京农业大学生命科学学院

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第一节概述 • 层析技术的分类：南京农业大学生命科学学院

第一节概述 • 层析技术的分类： • 按流动相的状态分类： • 用液体作为流动相的称为液相层析，或称液相色谱； • 以气体作为流动相的称为气相层析，或称气相色谱。 • 按固定相的使用形式分类：可分为柱层析(固定相填装在玻璃或不锈钢管中构成层析柱) 、纸层析、薄层层析、薄膜层析等。 • 按分离过程所主要依据的物理化学原理分类：可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析等。本章后续主要按第三种分类进行叙述。南京农业大学生命科学学院

第二节吸附层析 • 吸附层析技术是近代生物化学最常用的方法之一。 • 它是利用混合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小及分子极性等），使各组分随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对不同物质的不同吸附力而使混合物分离的方法。根据操作方法不同，吸附层析又分为柱层析和薄层吸附层析两种。 • 吸附层析是应用最早的层析方法，由于吸附剂来源丰富、价格低廉、易再生、装置简单、灵活，又具有一定的分辨率等优点，至今仍广泛应用于各种天然化合物和生物发酵产品等初级产品的分离制备，如尿激酶、绒毛膜促性腺激素等粗品的制备。南京农业大学生命科学学院

第二节吸附层析 • 凡能够将其它物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂。能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。在吸附层析中应用的吸附剂一般为固体。 • 吸附作用：固体内部的分子所受的分子间的作用力是对称的，而固体表面的分子所受的力是不对称的。向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外的一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。 • 吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由可逆的范德华力所引起的，故在一定的条件下，被吸附物可以离开吸附剂表面，这称为解吸作用。 • 吸附层析就是通过连续的吸附和解吸附完成的。南京农业大学生命科学学院

第二节吸附层析 • 影响吸附的因素： • 吸附剂的特性。 • 吸附现象发生在界面，因此吸附剂表面积愈大，吸附量愈多。吸附剂的这一特性，常用“比表面积”表示。比表面积指每克吸附剂所具有的表面积，例如活性炭的比表面积一般为300～500m3/g，有的甚至达到1000m3/g。 • 增加吸附剂表面积的方法有：将吸附剂磨碎成小的颗粒；通过处理使颗粒表面凹凸多变；使吸附剂成为凝胶状态；将吸附剂制成具有大量微孔的颗粒。 • 吸附物质的性质。 • 一般说来，极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。南京农业大学生命科学学院

影响吸附的因素： • 吸附剂吸附条件 • 温度。吸附过程一般是放热的，所以只要达到了吸附平衡，升高温度会使吸附量降低。 • pH。溶液的pH 往往会影响吸附剂或吸附物的解离情况，进而影响吸附量。对蛋白质或酶类等两性物质，一般在等电点附近吸附量最大。 • 吸附物的浓度。吸附达到平衡时，吸附物的浓度称为平衡浓度。一般规律是：吸附物平衡浓度愈大，吸附量也愈大。 • 盐的浓度。盐类对吸附作用的影响比较复杂，有些情况下盐能阻止吸附，所以，在低浓度盐溶液中吸附的蛋白质或酶常用高浓度盐溶液进行洗脱。但在某些情况下，盐能促进吸附，甚至有的吸附一定要在盐的存在下，才能对某种吸附物进行吸附。正是因为盐对不同物质的吸附有不同的影响，盐的浓度对于控制选择性吸附很重要，需要经过试验来确定合适的盐浓度。南京农业大学生命科学学院

第二节吸附层析 • 一、吸附柱层析 • 将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中，构成层析柱，层析时欲分离的样品自柱顶加入，当样品溶液全部流入吸附层析柱后，再加入溶剂冲洗。冲洗的过程称为洗脱，加入的溶剂称为洗脱剂。南京农业大学生命科学学院

将在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。即被吸附的物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒被再吸附，后面流下的溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸（溶解）能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力不同，移动速度也不同。吸附力弱而解吸力强的物质，移动速度就较快。 • 经过适当的时间以后，不同的物质各自形成区带，如果被分离的是有色物质的话，就可以清楚地看到色带（色层）。如果被吸附的物质没有颜色，可用适当的显色剂或紫外光观察定位，也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当的显色剂或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线。 • 吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。南京农业大学生命科学学院

第二节吸附层析 一、吸附柱层析 1. 层析柱 • 柱层析是利用玻璃柱装填固定相的一类层析方法。柱层析所用的玻璃柱，是一根适当尺寸的细长玻璃管，一般层析柱径高比为1∶ 10～1∶40，可根据实际需要选择。下端封闭只留下一个细的出口管。在柱的底部要铺垫细孔尼龙网、玻璃棉、垂熔滤板或其他适当细孔滤器，使装入柱内的固定相不致流失。 2. 吸附剂 • 吸附剂的性质与选择是吸附层析法的关键。如果选择得当，分离常可顺利进行，否则就不易分离。作为吸附层所用的吸附剂种类很多，一般分为无机和有机两大类，以无机吸附剂最常用。 • 常用有机吸附剂有：淀粉、纤维素、聚酰胺凝胶、大孔吸附树脂等。其中大孔吸附树脂和聚酰胺近年用于中药活性成分的分离。南京农业大学生命科学学院

2. 吸附剂 • 常用的无机吸附剂有极性的和非极性的两种。羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者，活性炭属后者。在实践中不论选择那种类型的吸附剂，都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。 • 羟基磷灰石（简称HA）的吸附容量高，稳定性好（在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用），因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。 HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。 • 硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。其硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。 • 氧化铝分酸性、碱性和中性三种，分别适用于不同酸碱性的化合物。南京农业大学生命科学学院

2. 吸附剂 • 上述吸附剂中，一般常用亲水性吸附剂。氧化铝、硅胶和硅藻土等是亲水性的，含水量越低，其活性越高，吸附能力也越强，所以在使用前可酌情除水活化。这类吸附剂对样品中亲水性强的组分具有较强的吸附作用和分离能力，可反复使用20次。硅藻土在国内外普遍用于尿激酶粗品的制备。 • 在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说，极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然。理想的吸附剂必需经过多次试验才能获得。南京农业大学生命科学学院

3. 洗脱剂 • 洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。合适的洗脱剂应符合下列条件： • 纯度较高；稳定性好；能较完全洗脱所分离的成分；黏度小；易和所需要的成分分开。 • 洗脱剂可根据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。一般蛋白质或核酸被极性强的羟基磷灰石吸附后，要用含有盐的缓冲液洗脱。而甾体或色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱。所用洗脱剂的浓度大小和极性强弱的选择，需通过试验确定。 • 在实践中，选择洗脱剂的顺序是由极性小到极性大（正向层析）。当把极性小的洗脱剂换成极性大的时，宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合使用，浓度则由低到高。总之，选用洗脱剂的原则是能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、洗脱时间短。南京农业大学生命科学学院

第二节吸附层析 一、吸附柱层析 4. 操作 • 柱层析的设备主要有层析柱、部分收集器、磁力搅拌器和恒流泵。有条件时，配置一台检测仪和一台记录仪就构成一个完整的层析系统。 • 层析柱 • 采用极细吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积是由吸附剂的量和膨胀度决定的。 • 吸附剂的用量 • 吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。当操作容量高时，吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于样品的100倍。南京农业大学生命科学学院

4. 操作 • 装柱 • 装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装法和湿装法两种。 • 干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂。此法不易将气泡排尽。 • 湿装法系先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生。这种装柱法对各种基质都适用。 • 装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在一定的操作压下（贮液器内液面与层析柱出口之间的压力差），控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。此时层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的标准。南京农业大学生命科学学院

4. 操作 • 上样和洗脱 • 经过平衡的层析柱，当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（当加入的样品量相同时，体积越小越有利于提高分辨率）。 • 待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（其体积用液面距固定相表面的高度约5厘米计），并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。 • 随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线（以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标，有合适的检测器和记录仪时，洗脱液流经检测器再收集，用记录仪可自动绘制洗脱曲线）。南京农业大学生命科学学院

理想的洗脱曲线如图3-1所示。图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。理想的洗脱曲线如图3-1所示。图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。南京农业大学生命科学学院

第二节吸附层析 一、吸附柱层析 • 注意： • 为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。 • 若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度（极性），成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱（方法见离子交换层析）。 • 由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。南京农业大学生命科学学院

第二节吸附层析 二、聚酰胺薄膜层析 • 聚酰胺薄膜（尼龙薄膜）层析是指样品溶液随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生氢键吸附能力的不同，而将各组分分离的方法。 • 聚酰胺是由己二酸与己二胺聚合而成或由己内酰胺聚合而成的高分子化合物。含有大量酰胺基团，其羰基可与含羟基的物质形成氢键，其亚氨基又可与硝基化合物或醌类形成氢键，而产生吸附作用。不同的物质由于形成氢键的能力不同，故吸附力也不同，通过吸附和洗脱就可达到分离目的。南京农业大学生命科学学院

二、聚酰胺薄膜层析 • 聚酰胺薄膜层析只适用于极性分子的分离。如，酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸类物质等。特别是在蛋白质的化学结构分析中，氨基酸衍生物，如DNS(二甲氨基苯磺酰)-氨基酸、DNP(二硝基苯)-氨基酸等的分析，灵敏度高，分辨力强，操作方便，速度较快。 • 洗脱时，洗脱剂取代被吸附物与聚酰胺形成氢键，而使被吸附物解吸。 • 各种化合物与聚酰胺形成氢键的能力主要由物质的分子结构所决定。此外也与所使用的溶液有关。一般用水作溶剂时形成氢键的能力最强，故容易吸附，难于洗脱。在有机溶剂中形成氢键的能力较弱，在碱性溶液中形成氢键的能力最弱，所以洗脱剂最好选用碱性溶液，如二甲基甲酰胺(DMF)溶液、稀氢氧化钠溶液或稀氨水等。南京农业大学生命科学学院

第三节分配层析 • 分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的层析技术，相当于一种连续性的溶剂抽提方法。 • 分配系数(K)是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值： • 分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力的影响。所以不同物质的分配系数不同。而在恒温恒压条件下，某物质在确定的层析系统中的分配系数为一常数。 • 分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。南京农业大学生命科学学院

第三节分配层析 • 在分配层析中，通常用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸着一种溶剂作为固定相，另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂沿固定相流动构成流动相，某溶质在流动相的带动下流经固定相时，会在两相间进行连续的动态分配。 • 当样品中含有多种分配系数各不相同的组分时，分配系数越小的组分，随流动相迁移的越快。两个组分的分配系数差别越大，在两相中分配的次数越多，越容易被彻底分离。南京农业大学生命科学学院

第三节分配层析 • 分配层析的种类： • 纸层析属于典型的分配层析，且系统简单，使用方便，在生物化学的发展中发挥过极其重要的作用。本节主要通过纸层析介绍分配层析的基本知识。 • 将硅胶、硅藻土等铺在玻璃或金属板上进行层析可构成薄层层析系统，由于薄层层析还可做吸附、离子交换等层析，将在本章第七节专门叙述。 • 在硅藻土上吸附或化学键合一定的溶剂，装到层析柱上，以气体为流动相可构成气液分配层析，即气相色谱系统。 • 在硅胶等固体材料上吸附或化学键合一定的溶剂，装到层析柱中，用一定的洗脱剂洗脱，可构成液液分配层析，这种系统在高效液相色谱中应用普遍。 • 气相色谱和高效液相色谱系统复杂，将在本章第九节和第十章专门介绍。南京农业大学生命科学学院

第三节分配层析 • 纸层析 • 滤纸一般能吸收22%-25%的水，其中6%-7%的水是以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，一般情况下较难脱去。纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离目的。 • 溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示： Rf = a/ b • 式中a：溶质斑点中心的移动距离；b：溶剂前沿移动的距离 • Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同， Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。南京农业大学生命科学学院

纸层析 • 影响Rf值的主要因素： • 物质的结构和极性 • 物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素。极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。 • 滤纸 • 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同型号的滤纸上进行层析时，所得到的Rf值也不相同。 • 此外，滤纸上所含的杂质也会影响Rf值，必要时要进行预处理，以去除杂质的影响。层析滤纸由高纯度的棉花制成。要求质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，并具有一定的纯度。南京农业大学生命科学学院

纸层析 • 影响Rf值的主要因素： • 层析所用的溶剂 • 同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时， Rf值不同。所以溶剂的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好。在好的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中被分离组分的Rf之差最好大于0.05。 • pH值 • 溶剂和样品的pH值会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的含水量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低。 • 为了避免或减少pH值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定的Rf值，通过调节溶剂或样品溶液的pH值，使pH值保持恒定。南京农业大学生命科学学院

纸层析 • 影响Rf值的主要因素： • 温度 • 温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积；同时在多元溶剂系统中，温度显著地影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。所以温度的改变使Rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。 • 展开方式 • 同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同的展开方式进行层析时，所得到的Rf值不相同。用下行法展开时， Rf值较大；用上行法展开时， Rf值较小；用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动， Rf值也较小。 • 样品溶液中杂质。样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。例如：氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。南京农业大学生命科学学院

第三节分配层析 • 纸层析 • 操作方法： • 样品处理。 • 用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需稀释。 • 点样。 • 点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。 • 平衡。 • 点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变溶剂系统的组成，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前沿，严重影响层析效果。平衡一般在密闭的层析缸内进行。南京农业大学生命科学学院

操作方法： • 展开 • 平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中开始展开。当溶剂前沿快到达滤纸另一端时，展开结束。按溶剂在滤纸上流动的方向不同分为以下几种方式： • 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因毛细管引力的作用从下向上流动。上行法操作简单，重现性好，是最常用的展开方法，但展开时间较长。 • 下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快，但Rf值的重现性较差，斑点易扩散。 • 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右的环形线(原线)上。 • 双向展开法：如果样品组分较多，用一种溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时，可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展开后吹干溶剂，将滤纸转动90度后再用另一种溶剂系统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。南京农业大学生命科学学院

操作方法： • 显色。为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示。 • 显色剂显示：被分离物质与显色剂生成有颜色的化合物，显示斑点位置。常用喷雾法、浸渍法或涂刷法。 • 紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，有些物质受紫外光照射会发出荧光，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点。 • 定性分析。层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的Rf值，就可以对物质进行定性。 • 定量分析。对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有： • 剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，通过分光光度计进行比色定量。 • 直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求出待测物的含量。 • 面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面积与物质含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积的方法求得物质的含量。南京农业大学生命科学学院

第四节凝胶过滤层析 凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可反复使用，适用于不同相对分子质量的各种物质的分离，已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。南京农业大学生命科学学院

第四节凝胶过滤层析 • 基本原理： • 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。南京农业大学生命科学学院

第四节凝胶过滤层析 • 基本原理： • 样品中各组分的流出顺序，可用分配系统Ka来量度： Ka=(Ve-Vo)/Vi • Ve：为洗脱体积，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积； • Vo：外体积，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积； • Vi：内体积，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。 • 当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出； • 若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出； • Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。南京农业大学生命科学学院

基本原理： • 内体积Vi可以从凝胶的干重和吸足水后的湿重求得，也可用小分子物质（如NaCl等）实际测量而得到（Vo+Vi）。 • 外体积Vo可用相对分子质量很大的物质溶液（如血红蛋白、印度黑墨水、相对分子质量为200万的蓝色葡聚糖-2000、铁蛋白等）通过实际测量求出。也可从下式间接计算： Vo = Vt –Vi -Vg • Vg：凝胶基质本身的体积；Vi：内体积；Vt：层析柱内凝胶床的总体积。 • Vt可通过测量柱内径和凝胶床高度计算出来，即 Vt = 0.25πR2h • 洗脱体积Ve可通过加进某一组分后实际测量而得，也可以在已知Ka后计算出来。即 Ve = Vo + KaVi 2014/11/3 南京农业大学生命科学学院 46

基本原理： • 在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液的体积等于Vo+Vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即Ka的最大值为1。然而在某种情况下Ka值会大于1。这种反常现象说明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程。 • 对于同一类型的化合物而言，组分的洗脱体积Ve与相对分子质量(Mr)的关系可用下式表示： Ve = K1- K2lgMr • K1，K2为常数。 2014/11/3 南京农业大学生命科学学院 47

第四节凝胶过滤层析 • 凝胶的选择： • 凝胶的种类很多，其共同特点是内部具有微细的多孔网状结构，其孔径的大小与被分离物质的相对分子质量大小有相应的关系。常用的有： • 聚丙烯酰胺凝胶 • 是一种人工合成凝胶，由丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺共聚而成。商品名称为生物胶P(Bio-Ge1P)。聚丙烯酰胺凝胶是完全惰性的，适宜于各种蛋白质、核苷及核苷酸等的分离纯化。缺点是遇强酸时酰胺键会水解，一般在pH2-11的范围内使用。 2014/11/3 南京农业大学生命科学学院 48

凝胶的选择： • 葡聚糖凝胶 • 由相对分子质量为4×104~20×104的葡聚糖交联聚合而成。由Pharmacia (GE)公司生产的商品名为Sephadex的葡聚糖凝胶，具有良好的化学稳定性等优点，为最常用的凝胶之一。 • Sephadex耐碱，在0.01mol/L盐酸中放置半年不受影响，故广泛用于各种物质的分离纯化。 • Sephadex有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、等多种型号、和粗、中、细、超细多种规格。 • G后面的数字越大，胶粒内的孔经越大，越适合于大分子的分离，但颗粒的机械强度随孔经的增大而降低，较高的操作压会使G75、G100、G150、G200等颗粒变形而使洗脱液的流速下降，故用上述型号的Sephadex进行层析时，流速慢，时间长。同型号的Sephadex，颗粒越细，在同样柱长的柱子中分辨力越好，但流速也越慢。 2014/11/3 南京农业大学生命科学学院 49

凝胶的选择： • 琼脂糖凝胶 • 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶，可制成不带电荷的琼脂糖，商品为Sepharose。Sepharose的孔经大，机械强度好，层析时流速较快，但只能分离相对分子质量较大的分子。 • 聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 • 商品名Sephacryl，是由甲撑双丙烯酰胺交联丙烯葡聚糖形成的球形凝胶颗粒，反压特别低，机械性能好，分离速度快，分辨率高，理化稳定性好，在SDS、6mol/L盐酸胍及8mol/L尿素中均可使用。 • Superdex • Pharmarcia公司提供的新型凝胶过滤介质，是将葡聚糖共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上制成的球形凝胶珠，流速快、反压低、非特异性吸附很低，因而样品回收率很高，理化稳定性很高，是目前分辨率和选择性最好的凝胶过滤介质。 2014/11/3 南京农业大学生命科学学院 50

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