急性毒性试验

1. 急性毒性试验

2. 急性毒性试验(单次给药毒性试验)主要观察对实验动物一次给药后所产生的毒性症状及其程度，出现和消失的时间，死亡的发生率并计算出其最大给药量，最小致死量、半数致死量(LD50)等。由于中药毒性常较小，单次给药往往不能表现明显的毒性作用，我国药政部门把一日内多次给药观察受试药物毒性的实验也称作急性毒性实验。急性毒性试验(单次给药毒性试验)主要观察对实验动物一次给药后所产生的毒性症状及其程度，出现和消失的时间，死亡的发生率并计算出其最大给药量，最小致死量、半数致死量(LD50)等。由于中药毒性常较小，单次给药往往不能表现明显的毒性作用，我国药政部门把一日内多次给药观察受试药物毒性的实验也称作急性毒性实验。 急性毒性试验的目的是推测新药对人的急性毒性的强弱。同时，它可以为长期毒性试验、生殖毒性试验、致突变试验等试验设计提供剂量选择依据和有关毒性信息，还可以推测受试药物毒性发生的速度和持续时间，与半数有效量(ED50)比较判断新药的安全系数。因此，急性毒性试验对了解新药的毒性是非常必要的。 鉴于种种因素造成急性毒性试验结果(症状和致死量)在不同实验室内有较大的差异，且耗费大量动物而所取得的动物毒性的信息量相对较少，因此，各国目前都在修订急性毒性试验的技术要求，希望能利用尽可能少的动物数量而取得有价值的信息，同样达到急性毒性试验的目的。

3. 第一节 急性毒性试验方法的有关问题 一、动物 (一)动物种 动物种(或系)的差异是动物急性毒性差异的主要原因，药酶则是毒性种差的重要原因之一。为推测新药对人的急性毒性，某些发达国家动物急性毒性试验要求包含非啮齿类动物(除家兔外)在内的两种动物，我国对此未作出明确规定。由于中药已在临床长期使用，一般认为，如尤特殊情况，使用一种动物已基本上达到急性毒性试验的目的。目前虽常用的实验动物是小鼠或大鼠。但在某些特殊情况下，例如受试物中已知含有强烈胃肠刺激物，就还应再采用非啮齿类大动物进行实验，否则，即使毒性较大(如巴豆)也并不能引起大、小鼠呕吐反应。

4. (二)动物的年龄、性别、体重 急性毒性受动物的健康状态、年龄、性别、遗传因素、体重、药物的吸收、分布、代谢、排泄和内分泌激素等的影响。未成年的动物药酶活性一般较低，对于经代谢后减毒的药物表现毒性较强。而且，年幼动物药物代谢功能和敏感度较易发生变化，性别间的特性也尚未确立，因此，口服毒性通常使用年轻的性成熟的动物，—般小鼠6—8周龄，两种性别，体重18-22g(同次试验体重相差不超过2g)，大鼠6—8周龄，两种性别，体重120～150g(同次试验体重相差不超过10g)。 (三)动物数量 视不同试验而异。最小致死量或半数致死量，小动物(大鼠、小鼠)试验组在三组以上，每组—般至少10只动物(雌雄各半)。一些国家对动物数和组数不作规定，因此，有只用3只一组经多组试验测得近似致死量或LD50者。大动物(犬、猴)并不—定要求得到LD50，可用少量动物采用剂量递增的方法观察中毒症状，求近似致死量即可。最大给约量试验—般要求用小鼠或大鼠20只即可。

5. 二、试验准备 实验应在符合GLP的实验室内进行，实验样品质量和稳定性应符合要求，与药效学及临床试验一致。 (一)样品液的配制 中药材町用浓缩煎剂或浸膏，中药制剂可用不含辅料的提取物加水或用o．5％羧基纤维素钠，0．5％吐温—80，5％阿拉伯胶等混悬剂、增溶剂配成混悬液等，尽可能配成水溶液，水不溶性成分可用植物汕配成油溶、乳浊液。也有用乙醇、聚乙醇等溶剂配成样品液者，但溶剂本身的急性毒性能干扰试验结果，因此，急性毒性试验报告中应对样品液的配制方法加以详细说明，必要时设溶剂对照组。 (二)样品液的浓度及给药容量 为了求得最低致死且或半数致死量，需要设不同剂量组，使部分组反应率在50％以上，部分组反应率在50％以下。不同剂量的设定有两种方式，—是浓度一定不同给药容量，另—种是容量一定不同给药浓度，两者各有所长。 浓度一定适用于某些已经固定浓度的制剂，其有利之处是避免了渗透、粘度、溶质颗粒的分散状态等理化性状不—致对毒性试验结果的影响，因此，浓度一定也可得到较好的结果，但由于动物的投药用量是有限的，范围较窄，按体重给药容量难以达到试验要求。因此，通常采用同容量不同浓度的给药方法，注射给药药液浓度应勺体液浓度等渗(至少不应低渗)，口服液不必作特殊考虑，对毒性低的中药制剂而言，应以能保持一定流动性的最大浓度作为口服样品液。

6. 三、给药方法 (一)动物禁食 动物购入后应在实验室观察1星期，口服给药前，为减少吸收差异和大容量给药造成胃急性扩张，小鼠和大鼠至少应停食4 -6h，要求一夜停食(不停水)，投药后再停食3-4h。 (二)给药途径 中药新药除临床给药途径外，—、二类新药还希望其他给药途径，水溶性药 物应同时采用静脉给药途径，其他如油剂，混悬剂之类可采用皮下给药途径。腹腔汁射在人体极少用，中药粗制剂成分复杂，动物毒性试验中也尽可能少用，以避免腹腔刺激性的干扰。 各给药途径的容量一般为小鼠0．4—0．5ml／20g(体重)，大鼠lml／l00g(体重)。小鼠口服最大容量不超过0．8ml／20g(体重)，其他途径不超过0．5ml／20g(体重)。大鼠口服最大容量不超过2ml／l00g(体重)，其他途径不超过lml／l00g(体重)。

7. 四、急毒试验观察指标和致死量的计算 (一)观察指标 不能把求得致死剂量看作是急性毒性实验的唯一要求。发现毒性症状及毒性反应的靶器官同样是急毒实验非常重要的目的。给药前后应观察体重、进食、进水的状况，密切观察异常毒性症状，特别是给药后的一、二日。以后1日至少观察1次，观察7 日观察症状包括①行动：不安定、多动、发声；②神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失调、姿态异常；③自主神经系统反应：眼球突出、流涎、流汨、排尿、下泻、竖毛、皮肤变色、呼吸；④死亡。应每日记录体重、毒性反应和死亡情况，濒死动物应单独饲养，死后及时解削进行肉眼观察和病理组织学观察。试验结束存活动物也进行解剖，如有病变进行组织学观察。 (二}致死剂量计算 可用Bliss点斜法、简化机率法、改进寇氏序贯法等计算最小致死量或半数致死量。Bliss法严谨精确，缺点是计算非常繁复。但近代有计算机软件，汁算方法可推荐Bliss法。各种方法原则基本相同，如：①剂量刘数值应为等差，即剂量应按等比级数排列；②各组动物数应相等；③死亡率应在50％上下基本对称分布等。但各种方法还各有特殊设计要求，如有的要求Dm和Dn必须为100％和0％死亡率等，可参考有关专著，此处不赘述。如受试物毒性低，测不出LD50，可求得最大给药量。

8. 第二节 急性毒性试验方法 一、LD50的测定 最小致死量是使动物刚好致死的药物剂量，但由于药物的性质，给药方法和个体差异，每只动物的最小致死量确很大的差异，实验和统训学原理表明一群动物最小致死量的平均值相当于半数致死量。半数致死量测定方法很多，但实验没计大同小异，所不同者为算方法的不同，其试验方法如下： 预试验：目的是找出0％及100％估计致死量。更确田地说是找到—个0死亡的最大剂量和100％死亡的最小剂量的估值以决定实验中采用的最大剂量(Dm)和最小剂量(Dn)，，这在测定中非常重要，是实验成败的关键。可用雌或雄性动物，设四组以上，每组3-4只，先用1；10的剂量比给药(如5mg／kg、50mg／kg、500mg／kg、5000mg／kg固定剂量)。观察7日，记录死亡动物数。然后在死亡数4／4和0／4两组之间按1；2(如50mg/kg、100mg/kg、200mg／kg、400mg／kg)以下的剂量比进行重复试验，以此测得近似的0和100％死亡率。

9. 正式试验：在预试验Dn和Dm剂量范围内按等比设三个以上剂量组，其组间剂量的比值，一般在1；0．6至1：0．9范围内。购入动物试验前应驯化1星期，随机或按体重分组，每组10只以上，雌雄各半，分别编号，给药前应禁食(不禁水)过夜。各给药组和溶剂对照组按体重给药后，试验当日应多次观察，第二日至最后—日应每日有二人以上同时观察1次并及时详细汜录毒性反应症状，症状出现和消失的时间，死亡时间，第七日全部动物测量体重处死并剖检，肉眼观察病变情况。有毒性反应、体重减轻或脏器有病变的动物应在剖检后立即进行主要脏器的病理组织学观察。正式试验：在预试验Dn和Dm剂量范围内按等比设三个以上剂量组，其组间剂量的比值，一般在1；0．6至1：0．9范围内。购入动物试验前应驯化1星期，随机或按体重分组，每组10只以上，雌雄各半，分别编号，给药前应禁食(不禁水)过夜。各给药组和溶剂对照组按体重给药后，试验当日应多次观察，第二日至最后—日应每日有二人以上同时观察1次并及时详细汜录毒性反应症状，症状出现和消失的时间，死亡时间，第七日全部动物测量体重处死并剖检，肉眼观察病变情况。有毒性反应、体重减轻或脏器有病变的动物应在剖检后立即进行主要脏器的病理组织学观察。 LD50和最小致死量及其可信限的汁算可采用Bliss法，改进寇氏法、点斜法、简化概率单位法或其他的计算方法。汁算结果对比表明，不同的汁算方法，结果间一般无明显差异，而不同实验室对同一样品试验结果却常见有显著差异。冈此，采用较简单的计算方法完全可以满足LD50计算的准确性。

10. 二、最大给药量试验 如同受试药物的浓度或体积限制，无法测出半数致死量(LD50)时，作最大给药量试验。试验选用拟推荐临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度(溶液仍有较好的流动性)，最大体积的给药量1次或1日内2～3次给予动物。以小鼠口服为例：动物数不得少于20只，雌雄各半，容量—次不超过0．4ml/10g(体重)，多次给药间隔时间不低于4h，观察7日，汜录毒性反应和体重变化。如仍未见毒性反应或体重正常增加，则可认为该药物小鼠最大给药量未见毒性反应，或LD50大于最大给药量。经统计学计算，该剂量不可能大于LD14。如用10只动物未见毒性反应或死亡则该剂量不可能大于LD26。

11. 三、近似致死量试验 国外近年来有采用少量动物进行近似致死量测定的方法。其中有的类似LD50的预试验或霍恩氏法。每组用3—4只动物，设多组，详细观察并汜录动物毒性反应井进行血液学，血液生化以及病理组织学观察。有的采用剂量递增法即—只动物一个剂量以几何级数递增，根据前个剂量的反应，决定下—个剂量。或采用剂量累积法，同一批动物间隔一定时间、剂量由小到大给药，观察毒性反应，同时结合血药浓度的测定，确定动物的急性毒性反应、靶器官、中毒或致死剂量、毒性反应时的血药浓度。剂量递增法类似于LD50测定的阶梯法(或称序贯法、上下法)，适用小动物而且毒性反应出现快的试验，10—20只动物即可测定。剂量累积法则适用大动物，利用大约6只合格动物即可进行急性毒性试验的全面观察。另外，国外还有采用固定剂量给药观察近似致死剂量，以决定药物毒性大小者。

12. 四、急毒试验结果评价 (一)可靠性评价 为保证急毒结果，实验条件应符合GLP的要求，供试品质量稳定，动物合格，实验方案，实验原始记录，标准操作规程，总结报告应符合要求。总结报告中应包括摘要、供试品、试验动物，试验环境、给药方法、观察方法、毒性反应症状、体重变化、病理组织学变化、雄性反应和死亡出现的时间、LD50和LD5及其可信限的计算方法、结果讨论等。根据试验结果对急性毒性进行全面评价。

13. (二)安全性评价 (1)根据急性毒性试验结果判断供试药物毒性的强弱、类型。国内尚无统—规定。 (2)急性毒性试验结果对临床研究有指导意义，可以为临床研究时探索安全有效剂量避免出现急性不良反应提供依据。 但是，鉴于人体与各种动物对各类化合物的吸收、分布、代谢、排泄以及各类型毒性反应的差异，尚无规律可循，现有化学药品统计数据表明，在进行临床研究时，仍应根据实验结果参考文献资料报道进行由低到高的安全治疗剂量的探索。 (3)急性毒性试验结果对推测长期毒性试验剂量具重要意义，、不同种动物之间的差异，急性毒性结果无论用体重剂量还是体表面积剂量计算常见有差异而尚无规律。如果急性毒性试验与长期毒性试验采用同种动物，则急性毒性试验的剂量对长毒有更大的参考价伉。即使如此，还应考虑该药的蓄积作用。不同种动物间虽然也可以进行剂量推测但仅可作为参考．仍需要长期毒性试验前进行必要的预试验。

14. 三、动物规格和数量 长期毒性实验一般由雌雄各半、健康无病、检疫合格的动物组成。各组平均体重相似，体重变异不超过20％。对照组动物数，可以与给药组相同，也可按公式计算：对照组动物数：给药组动物数x剂量组数的平方根。 试验周期3个月之内的，啮齿类宜用6—8周龄的大鼠，每组数量不少于20只；非啮齿类可用6—10月龄的犬，每组数量6只；试验周期3个月以上的，啮齿类宜用5、6周龄的大鼠，每组数量应增至30-40只。非啮齿类可用4-6月龄的犬，每组数量6只。确定每组动物数的原则，主要考虑药物毒性致实验动物死亡数，实验中处死动物的批次和实验结束时及停药后观察恢复状况所需能用于统计分析的动物数。

15. 四、饲养条件 (1)通风良好：动物饲养室的换气次数和气流速度能控制在10～15次／h和13—18cm／s较好，目的是利于动物的散热及排除臭气、粉尘和微生物，又不明显影响室内的温、湿度和动物的耗能。 (2)光照规律：因生物节律对动物的反应性有明显的影响，光照会影响动物的生物节律从而影响不同批次之间的毒性对比。大鼠、小鼠应为12h明，12h暗；仓鼠应是14h明，l0h暗。 (3)环境清洁：微生物或寄生虫感染等，均叫能影响毒性试验的结果。有条件者应尽可能选用清洁级、SPF级试验设施。 (4)温、湿度适中且稳定：常温动物在15—33C下，体温波动在1. 5C以内。湿度是种潜热，宜控制在30％—70％。温度、湿度的突然变化，体温虽然变化不大，但并不意味着动物的生理状况未受影响，同样可以导致动物对外环境变化的抵抗力降低，影响毒性实验结果。 (5)室内噪声最好在50dB以下：雌雄分养，不宜拥挤，必要时(如掺饲给药或需精确测定饮食量时)单笼饲养，但要注意单养和群养的动物刘药物的反应是有差异的。各剂量组和对照组的饲养条件应等同。室内饲养另种动物，或其他饲养条件的突然改变，均可引起实验动物应激反应，从而影响毒性实验结果。 (6)食物应清洁，无霉变：食物中的脂肪、蛋白质、碳水化合物等营养成分要符合各种动物的生理需求目恒定，因有时营养成分对药物的毒性也有很大的影响。饮水要洁净，防止病源微生物、重金属或其他有毒物质的污染。

16. 长期毒性实验

17. 本书的长期毒性实验与国际现行的反复给药的毒性实验概念是基本一致的，包含了过去“亚急性毒性实验”、“亚慢性毒性实验”、“慢性毒性实验”及“终身毒性实验”等称谓。本书的长期毒性实验与国际现行的反复给药的毒性实验概念是基本一致的，包含了过去“亚急性毒性实验”、“亚慢性毒性实验”、“慢性毒性实验”及“终身毒性实验”等称谓。 长期毒性实验的主要目的有：—是观察药物在选定时间内反复给予动物的情况下，动物出现损害的靶组织或器官及剂量—效应关系和可逆性等；二是了解实验动物对药物能耐受的剂量范围和对人来说可能无毒的安全剂量。 组成长期毒性实验的三个主要部分是实验动物、受试药物和观察指标。长期毒性试验赞时、费力，故必须根据新药类别、受试物性质和用途、疗程长短、急性毒性试验和长期毒性预试验结果等周密考虑，精心设计，以避免难以弥补的缺失。长期毒性试验设计一般需要重点考虑以下几个方面。

18. 第一节 实验动物 一、动物种类 (1)我国对中药三、四类新药，处方中各味药材均符合法定标准，无毒性药材，无十八反、十九畏等配伍禁忌，又未经化学处理(水、乙醇粗提者除外)，难以测出LD50，而给药量大于20g(生药)／kg(体重)，临床用药期为1星期以内者可免做长期毒性实验。 (2)符合上述条件，用药1星期以上者及需反复应用的药物，规定可只选用大鼠进行长期毒性实验。 (3)对一、二类新药以及含有毒药材、非法定标准药材，或有十八反、十九畏等配伍禁忌的三、四类中药新药，我国及各国药政部门普遍规定，长期毒性实验应用啮齿类和非啮齿类二种动物进行。啮齿类中，大鼠公认为首选动物，其次是小鼠、地鼠或豚鼠等；非啮齿类中，常用的是犬，也可根据需要选用猴、猫、兔或小型猪等。

19. 二、动物品系 实验应选用封闭群动物，如啮齿类的Wistar或Sprague Dewley品系大鼠，非啮齿类的Beagle犬。既易得、易养、易于操作，又接近实际用药人群的基因组成情况。除非有特殊目的，一般不用近亲繁殖的动物。也有认为杂交第一代鼠兼有对药物反应波动少和接近人群基因组成情况的优点而提倡选用的，尚未被普遍接受。由于不同国家、不同实验室的动物经过长期传代，其品系基因已发生了很大的变化，因此长期毒性实验动物必须来源清楚，并有繁殖生产合格证号。

20. 三、动物规格和数量 长期毒性实验一般由雌雄各半、健康无病、检疫合格的动物组成。各组平均体重相似，体重变异不超过20％。对照组动物数，可以与给药组相同，也可按公式计算：对照组动物数：给药组动物数x剂量组数的平方根。 试验周期3个月之内的，啮齿类宜用6—8周龄的大鼠，每组数量不少于20只；非啮齿类可用6—10月龄的犬，每组数量6只；试验周期3个月以上的，啮齿类宜用5、6周龄的大鼠，每组数量应增至30-40只。非啮齿类可用4-6月龄的犬，每组数量6只。确定每组动物数的原则，主要考虑药物毒性致实验动物死亡数，实验中处死动物的批次和实验结束时及停药后观察恢复状况所需能用于统计分析的动物数。

21. 四、饲养条件 (1)通风良好：动物饲养室的换气次数和气流速度能控制在10～15次／h和13—18cm／s较好，目的是利于动物的散热及排除臭气、粉尘和微生物，又不明显影响室内的温、湿度和动物的耗能。 (2)光照规律：因生物节律对动物的反应性有明显的影响，光照会影响动物的生物节律从而影响不同批次之间的毒性对比。大鼠、小鼠应为12h明，12h暗；仓鼠应是14h明，l0h暗。 (3)环境清洁：微生物或寄生虫感染等，均叫能影响毒性试验的结果。有条件者应尽可能选用清洁级、SPF级试验设施。 (4)温、湿度适中且稳定：常温动物在15—33C下，体温波动在1. 5C以内。湿度是种潜热，宜控制在30％—70％。温度、湿度的突然变化，体温虽然变化不大，但并不意味着动物的生理状况未受影响，同样可以导致动物对外环境变化的抵抗力降低，影响毒性实验结果。 (5)室内噪声最好在50dB以下：雌雄分养，不宜拥挤，必要时(如掺饲给药或需精确测定饮食量时)单笼饲养，但要注意单养和群养的动物刘药物的反应是有差异的。各剂量组和对照组的饲养条件应等同。室内饲养另种动物，或其他饲养条件的突然改变，均可引起实验动物应激反应，从而影响毒性实验结果。 (6)食物应清洁，无霉变：食物中的脂肪、蛋白质、碳水化合物等营养成分要符合各种动物的生理需求目恒定，因有时营养成分对药物的毒性也有很大的影响。饮水要洁净，防止病源微生物、重金属或其他有毒物质的污染。

22. 第二节 受试药物 一、药物形式 应与临床试验用制剂完全—致(除可以不含赋形剂外)。三类以下的中药新药复方制剂，体积较大，以不含赋形剂如中药浸膏作受试物为宜。固体制剂灌胃给药，不溶于水的可制成馄悬液。混悬液要均匀，固体物先磨成80目以上的细粉，再加1％左右的羧甲基纤维素钠或10％左右阿拉伯胶助悬，冰箱放置，临用前摇匀，短期内用完，以免受试物活性下降。

23. 二、给药途径和方法 给药途径应尽量与临床一致。口服药物可灌胃或掺饲给药。灌胃给药有血药高峰期：掺饲给药血药浓度波动较小，维持时间较长。静脉注射或肌内注射给药可以肌内注射或皮下注射。腹腔注射时大部分药物依然是首先入肝，因此不能完全代替临床注射给药途径。 皮下注射，大鼠每l00g体重不超过1ml，小鼠为0．1—0．3ml／l0g(体重)。肌内注射，大鼠每腿不超过0．5ml，小鼠每腿不超过0．3ml。注射给药应严格消毒，并需经常变换注射点以减少对局部的刺激，还应考虑药液的酸碱度和渗透压。 灌胃容积，大鼠一般每100g体重1—2ml，小鼠为0．1-0. 3ml／l0g(体重)。犬等大动物常采用口服或掺饲给药。从营养考虑掺饲药量不宜超过摄食量的5％。掺饲给药(掺入饲料或饮水中给药)应有保证摄入规定药量的措施，还应有均匀混合、稳定性及质量检杳等措施。对中药复方制剂很难做到这点，必须掺饲，给药时，采用现喂现掺的方法较好。 长期毒性实验的给药量应根据动物体重的变化不断调整，一般每期称量体重并调整药量1次。各剂量组应采用等容量不同浓度给药。

24. 三、给药分组 (1)应设3个或9个以上的剂量组。高剂量组应有少数动物出现严重毒性反应或死亡(不超过20％)，低剂量组应相当或略高于药效学试验的有效剂而不出现毒性反应，中剂量组在高低剂量组之可以等比关系排列。中药—般毒性较低，体积较大。在即使最大限度提高剂量(技术上能投给的最高剂量)仍不能使动物中毒死亡的情况下，高剂量组应相当于临床用量50倍以上，虽低不能低于临床剂量的30倍(按千克体重计算)，且必须高于药效学实验的高剂量组。 (2)如采用临床试验用制剂，对照组应给等容量的赋形剂，应注意有时赋形剂或溶剂的种类和用量会影响药物的实验结果。如采用不含赋形剂制剂，对照组可给等容量的水等溶剂。如赋形剂或溶剂可能产生毒性时，还需另设空白对照组。

25. 四、给药周期 不应少于临床疗程的1倍。≤新药审批办法·中药药理毒理研究的技术要求≥中规定：中药三、四类新药，处方中各味药材均符合法定标准，无毒性药材，无十八反、十九畏等配伍禁忌，又未经化学处理(水、乙醇粗提除外)，难以测出LD50而给药量大于20g生药／kg(体重)，临床用药期为1早期以内者町免做长期毒性实验。1星期以上者及需反复应用的药物，可选用大鼠进行长期毒性实验。对一、二类新药以及含有毒药材、非法定标准药材或有十八反、十九畏等配伍禁忌的三、四类中药新药，长期毒性实验应用啮齿类和非啮齿类两种动物进行。给药周期：啮齿类一般不超过6个月，非啮齿类不超过9个月。

26. 第三节 观察指标 一、检测次数 试验周期在3个月以内的，末次给药后24h，每组活杀部分动物(1／2—2／3)，检测各项指标，余下动物停药继续观察2—4星期之后，同样活杀全面检测，以了解可能出现的迟缓性毒忭和毒性反应的可逆程度。试验周期在3个月以上的，可增加在实验中期活杀少量动物(如高剂量组和对照组)检测各项指标。

27. 二、检查项目 (一)一般检查 (1)长期毒性试验的症状发生得快慢不—。因此，在给药开始l星期内须严密观察，以后每日至少观察一次行为活动、外观体征、粪便性状等。非啮齿类动物还可以观察刘刺激的反应等更高一层的行为变化。 (2)体重，反映动物的生长和一般健康状况，也是反映毒性的敏感指标，同时给约量的调也需根据体重的变化，因此至少每星期称量记录1次。 (3)摄食量的测定应与体重变化同时测定。摄食量(g)／体重增加(g)是说明体重变化原因的重要指标。 (4)摄水量的测定有时是必要的。对可能影响饮水量、尿量的受试药物，或掺入饮水绐药时，应测定摄水量。 (5)死亡，是中毒最明显的表现，但须注意与自然死亡或意外死亡的区别．应及时进行剖检和记录。对濒死动物应立即处死，剖检和进行血液学、血液生化及病理组织学检查。

28. (二)实验室检查 1．血液学 血常规(纤细胞和网织纤细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数、白细胞分类、血小板计数)、出凝血时间等。反应骨髓造血功能，外周各类血细胞的受损或活动情况，凝血机制的影响程度等。 2．尿液 尿量、尿常规(尿蛋白、尿糖、尿血红蛋白等)检查，反应肾脏功能、心脏和内分泌功能。 3 血液生化 血液生化检测反应动物体内各系统、各组织器官的功能状态或受损情况。若能预测毒性作用的靶器官，可以有目的地选择指标，否则原则上应尽可能多地进行检测。啮齿类受到血液量的限制，非呐齿类虽不受采血量限制，但实际上不可能无限制地选择检测项目，因此，—般首先选择下列指标以初步厂解受试药物对机体的毒性概况，为较深入地研究受试药物的毒性指明方向。

29. (1)丙氨酸氨基转换酶：主要反应肝脏受损情况，其次为由心脏病变引起的肝脏淤胆或郁血。 (2)总胆红素：反应肝脏解毒功能和胆道排泄状况或溶血等。 (3)碱性磷酸酶(ALP)：增高反应骨骼受到影响或肝脏排泄受阻或甲状旁腺功能亢进。 (4)尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)：增高反应肾脏功能受损或蛋白质分解增强或脱水。 (5)天冬氨酸氨基转换酶：主要心脏受损情况。 (6)总蛋白(TP)：用以求出球蛋白含量。 (7)白蛋白：常见其浓度降低，反应肝脏合成功能或胃肠消化吸收受影响后的摄 入不足或肾脏受损丢失过多。其浓度增高见于脱水及血液浓缩。 (8)球蛋白：常见是其浓度增高，反应受到感染或机体免疫功能亢进。其浓度降 低较少见，原因可能是丢失增多或体液免疫受损。 (9)血糖(GLU)：增高或降低均上要与内分泌系统改变有关。 (10)总胆固醇(T—CHO)：增高见于代谢减退，脂类动员增加等。

30. (三)病理组织学检查 病理组织学检查目的足了解受试药物毒性引起的质性改变，是诊断毒性反应的重要指标。对给药期间死亡动物、濒临死亡和计划活杀动物都应进行病理组织学检杳。正确肉眼观察记录的同时要保留相应的影像、照片等资料。常用方法和注意事项如下。 (1)处死动物时，要考虑到组织器官免受损伤，也要考虑到动物免受痛苦和应激反应。常用的麻醉后颈动脉或腹主动脉放血的方法比较合理。 (2)进行剖检时，应观察皮肤、口鼻、眼耳等外观，再剥离皮肤观察皮下组织，最后剪开腹腔、胸腔及颅腔观察内腔组织器官及注射部位，包括组织器官的正常位置、形状大小、颜色硬度及剖切面。取出的组织应放在顶先排定组织器官名称扦盛有生理盐水的容器中．以防漏取及干燥。 (3)取材原则上应尽量广泛。考虑到中药的特点，可根据急毒实验发现有病变的器官组织和中药药性可能出现中毒的靶器官、靶组织具体确定。应包括心、肝、脾、肺、肾等重要的实质性器官组织。剖取的实质性脏器应称重。 (4)病理切片原则亦应尽量广泛。在同一张片上尽量含有同一器官组织的不同层面。实际操作中可先对高剂量组动物及尸解发现异常器官进行重点切片检查，在高剂量组发现有异常病变时再进行详细检查。

31. 皮肤黏膜用药的毒性试验

32. 皮肤黏膜用药即局部用药，包括皮肤用药、直肠或阴道给药、滴眼药、滴鼻药、滴耳剂、吸入剂及口腔咽喉用药等。主要考察它们的局部毒性作用和局部用药后引起的全身毒性作用。如果是局部用药治疗全身疾患的，还应参照全身用药的规定做长期毒性试验。三、四类外用药治疗局部疾患且方中不含毒性药材或有毒成分的，—般可不做长期毒性试验，但需做局部刺激试验、过敏试验，必要时需做光敏试验。有关皮肤黏膜用药的毒性试验分述如下。皮肤黏膜用药即局部用药，包括皮肤用药、直肠或阴道给药、滴眼药、滴鼻药、滴耳剂、吸入剂及口腔咽喉用药等。主要考察它们的局部毒性作用和局部用药后引起的全身毒性作用。如果是局部用药治疗全身疾患的，还应参照全身用药的规定做长期毒性试验。三、四类外用药治疗局部疾患且方中不含毒性药材或有毒成分的，—般可不做长期毒性试验，但需做局部刺激试验、过敏试验，必要时需做光敏试验。有关皮肤黏膜用药的毒性试验分述如下。

33. 第—节 皮肤黏膜用药急性毒性试验 皮肤黏膜用药急性毒性试验目的是，观察动物皮肤(完整皮肤和破损皮肤)或黏膜短时期(一般为单次，或中药制剂毒性较低，24h内数次)接触受试物，因吸收作用而使机体产生毒性反应。 一、动物 常用动物为成年健康的白色家兔、白色豚鼠、白色大鼠或白色小型猪，雌雄各半。婴儿用药用年轻的动物，如白色家兔(1．5kg左右)、白色豚鼠(o. 2kg左右)。

34. 二、试验方法 (一)皮肤准备 动物给药前24h背部脊柱两侧去毛(剪、剃，或适宜脱毛剂)，去毛面积约为体表面积的10％(家兔约150cm2，豚鼠约40cm2，小型猪约300cm2)。去毛后24h检杳去毛皮肤是否因去毛而受伤，受伤的皮肤不能作完好皮肤的毒性试验。破损皮肤的制作采用不同方法将去毛消毒皮肤划破(消毒手术刀作井字划破或砂纸磨擦打毛)，以渗血为度。 (二)黏膜给药 尽量模拟临床的用药途径。保证受试物与黏膜接触4h以上。 需设赋形剂对照组。如赋形剂有毒性，应再设空白对照组。

35. (三)受试药 原则上尽量与临床用制剂一致，并保证受试物与皮肤接触良好。 1．剂量设置 (1)如果受试物毒性较大．预试验时提高剂量可使大部分动物死亡，应按全身给药的原则，没置几个剂量组(完整皮肤组和破损皮肤组备数个剂量组)。具体方法可参见本篇“急性毒性试验”。动物宜采用大鼠或豚鼠。 (2)如果受试物毒性较小，可只一个剂量组。每组家兔或猪4只，如用豚鼠需10只。并增加其他给药途径的最大给药量试验。

36. 2．给药方法 受试物如为膏剂或液体剂型，可直接涂抹于去毛皮肤；如是固体粉末或中药散剂，需加适量水或其他赋形剂(如羊毛脂、凡上林、橄榄油等)混合均匀，以保证受试物与皮肤接触良好。 药物涂抹后应以适当的法固定，如用无刺激性纱布、胶布或有孔尼龙绷带固定；豚鼠或大鼠可用剪去指套的乳胶手套包住整个背部和腹部；如受试物是液体，应先覆以聚乙烯薄膜，防止液体挥发。同时要注意防止试验动物舔食受试物。 黏膜用药，如直肠或阴道或滴鼻或吸入用药时，可将动物固定；口腔用药时，可将药物涂抹在下唇与龈之间(不能排除动物舔食受试物)；或提高受试物的黏稠度；或分次数用药，目的是要保证受试物与黏膜接触4h以上。 有些毒性很小的外用制剂，也可用全身给药途径(如皮下注射等)反应其毒性。受试物剂量应以同面积不同浓度为宜。如采用其他方法，应说明理由。

37. 3．给药周期 皮肤黏膜用药的急性毒性试验时，受试物与皮肤或黏膜接触不超过24h。根据中药特点，可适当提高浓度或增加24h内用药次数。给约24h后，用温水或无刺激溶剂除去残留受试物。 三、观察记录与检查 除去受试物后每日观察至第七日，记录动物的体重、皮肤毛发、眼和黏膜的变化，中毒表现的观察项与全身给药的急性毒性实验相同。若有死亡动物，应及时进行尸检，有肉眼可见的病变应进行病理组织学检查。

38. 第二节 皮肤黏膜用药长期毒性试验 皮肤黏膜用药急性毒性试验目的是，观察动物皮肤(完整皮肤和破损皮肤)或黏膜反复多次接触受试物，因吸收作用而使机体产生的毒性反应。 一、动物 常用动物为成年健康的白色家兔(2kg左右)、白色豚鼠(0．3kg左右)、白色大鼠(0．2kg左右)或白色小型猪(7kg左右)，雌雄各半。婴儿用药应用更年轻的动物，如白色家兔(1．1kg左右)、白色豚鼠(0．2kg左右)。

39. 二、实验方法 (一)皮肤准备 皮肤长期毒性试验和皮肤急性毒性试验的皮肤准备相同。 (二)受试药物 原则上尽量与临床用制剂—致，并保证受试物与皮肤接触良好。 1．剂量设置 皮肤黏膜用药的长期毒性试验，一般设高、低两个剂量组和一个对照组。高剂量组应是使动物产生严重毒性反应或有少数动物死亡的剂量，低剂量组应相当或略高于药效学有效剂量。具体方法可参见本篇“长期毒性试验”。如急毒试验浓度超过临床用量20倍(经剂量转换)而未出现毒性反应或死亡，叫只设一个相当临床用量20倍以上的剂量组和一个对照组。每组家兔6只或小型猪4只，如用豚鼠需10只。

40. 2 给药方法 受试物如为膏剂或液体剂型，可直接涂抹于去毛皮肤上；固体粉末或中药散剂，需加适量水或其他赋形剂(如羊毛脂、凡士林、橄榄油等)混合均匀，以保证受试物与皮肤接触良好， 药物涂抹后应以适当的力法固定，如用无刺激性纱布、胶布或有孔尼龙绷带固定；豚鼠或大鼠可用剪去指套的乳胶手套包住整个背部和腹部；如受试物是液体，应先覆以聚乙烯薄膜，防液体挥发。同时要注意防试验动物舔食受试物。 黏膜用药，如直肠或阴道或滴鼻或吸入用药时，可将动物固定后进行；口腔用药，可将药物涂抹在下唇与齿龈之间(不能排除动物舔食受试物)；或提高受试物的黏稠度；或增加用药次数。目的足要保证受试物与黏膜接触4h以上。 受试物剂量应以同面积不同浓度为宜。如采用其他方法，应说明理由。 毒性很小的中药外用制剂，也可用全身给药途径(如皮下注射等)反应具毒性。

41. 3．给药周期 皮肤黏膜用药长期毒性试验时，给药时间不少于临床用药疗程的两倍，具体用药周期可参照全身用药的长期毒性试验。每周给七次，每日1次，每次6h黏膜用药至少4h)。 三、观察记录与检查 皮肤黏膜用药的长期毒性试验，观察项包括血液学，血液生化和病理学检查均同全身给药的长期毒性试验，只是受试物涂抹的局部皮肤应列为检查刘象。

42. 第三节 皮肤刺激试验 试验目的足观察动物皮肤接触受试物后产生的刺激反应情况。分为1次给药的皮肤刺激实验和多次给药的皮肤刺激试验。 一、动物 选成年健康的白色家兔(2kg左右)，其次是白色豚鼠(0．3kg左右)。婴儿用药应用更年轻的动物，如白色家免1．5kg左右，白色豚鼠0．2kg左右。 二、受试物 应尽量与临床用制剂—致。粉末或中药散剂，需加适量水或其他赋形剂时，也应参考临床使用方法，合理配制。

43. 三、试验方法 至少用3只家兔或5只豚鼠。给药前24h，动物背部去毛。分完整皮肤给药区、破损皮肤给药区、完整皮肤对照区、破损皮肤对照区4个区，每区均为体表面积的3％—5％，各区之间留有适当距离。破损皮肤制造方法、给药和固定方法等同皮肤毒性试验。给药区涂抹受试物 (固体)或1ml(液体)，对照区涂以等量赋形剂，二层纱布覆盖，适当方法固定。 一次给药的皮肤刺激实验，24h后以温水或无刺激性溶剂洗去残留受试物和赋形剂，观察1h，24h、48h、72h涂抹部位的红斑和水肿等反应。原发反应在1—2日内达到最剧，消退较快，多次给药的皮肤刺激实验，每日涂抹1次，连续1星期或以上。其他同1次给药的皮肤刺激实验。

44. 第四节 皮肤过敏性试验 皮肤过敏性试验的目的足观察在重复接触受试物后，受试物作为致敏原引起的变态反应在皮肤上的表现。皮肤过敏性试验可以分成两大类，一类是使用佐剂(或称免疫增强)的方法，一类是不用佐剂的方法。 一、动物 原则上选择敏感性高的动物。一般用白色豚鼠，250—300g(或1—3个月龄)，雌雄齐半。每组10只，或由是否会影响结果评价决定。 二、阳性对照 对—苯二胺，1—氯—2，4—二硝基苯、二铬化钾、璜胺新霉素、磺化镍等。

45. 三、受试物 受试物如为膏剂或液体剂型，可直接涂抹于去毛皮肤；如是固体粉末或中药散剂，需加适量水或其他赋形剂(如羊毛脂、凡士林、橄榄等)混合均匀，以保证受试物与皮肤接触良好。 确定剂量应考虑受试物的溶解性等性质，局部、全身的耐受性等。必要时应能陈述所用剂量的理由。 四、试验方法 给受试物(致敏或激发)前24h，动物颈背部两侧脱毛，—侧用于致敏涂敷，另—侧用激发涂敷。脉鼠去毛范围约3cm~3cm(或2cmx4cm)。试验组动物背部 侧脱毛处涂敷受式物，阴性对照组动物背部．脱毛处涂敷赋形剂，阳性对照组动物背部一侧脱毛处涂敷1％DNCB(或其他阳性对照药)，均持续6h动物分笼饲养。14日后，在动物背部另一侧，试验组涂敷受试物，阴性对照组涂敷赋形剂，阳性对照组涂敷o．1％DNCB(或其他阳性对照药)。6h后，去掉涂敷物，即刻观察皮肤过敏反应情况，之后于24h、48h、72h再次观察。以上是代表性步骤。测试皮肤过敏反应的还有其他方法，据报道认为福氏完全佐剂法的敏感忭略高。简述如下：

46. (一)不用佐剂的方法 l，Buehler试验法 包敷封闭式涂敷受试物致敏，2星期后包敷封闭式涂敷受试物激发。 2，Dmize试验法 皮内注射受试物致敏，2星期后皮内注射受试物激发。 3．敞开式敷皮试验法(open eplcutmeo test) 按临床拟用方法，反复涂敷受试物致敏。2星期后涂敷受试物激发。 (二)使用佐剂的方法 1 佐刑贴敷试验法 ①颈背部脱毛区四角各皮内注射蒸馏水和福氏完全佐剂(1；1)乳化剂(油包水，W／O)0．1ml。②在注射部位用注射针呈井字擦伤皮肤，③24h，将受试物(0．1mI或0. lg)涂敷破损皮肤上。①步骤②—③每日重复1次，连续3次。⑤致敏第一日起计算，1星期后，皮内注削部位涂敷10％月桂醇硫酸钠的凡士林液。⑥在同一部位包封式涂敷受试物(0．2ml或0，1g)致敏，保持48h。⑦致敏结束2期后，在背部或侧腹脱毛处，敞开式涂敷受试物激发。⑧根据24h，48h的皮肤反应，坪价受试物的过敏性反应。

47. 2 . 最大限度试验法 ①颈背部脱毛区左右对称皮内注射燕馏水和福氏完全佐剂(1：1)乳化剂(油包水，W／O)0．1ml．受试物0．1ml，受试物和FCA乳化剂0．1ml。②1星期后，皮内注射部位涂敷含10％月桂醇硫酸钠的凡士林液。③包封式涂敷受试物(0．2mi或0. 2z)致敏，保竹48h。④致敏结束1星期后，在背部或侧腹预先脱毛处，包封式徐敷受试物(0．1ml或0．1g)24h激发。⑤贴敷除后24h、48h观察皮肤反应。 3．福氏完全佐剂法(FCA) 受试物溶解在蒸馏水与福氏完全佐剂的等量混合液中，再皮下注射。 4．最佳试验法(optmnzatmn test) 先用福氏完全佐剂加强，包封式涂敷或皮内注射受试物致敏。 5 破损皮肤佐剂试验法(split od juvant) 用冰接触损伤皮肤，使用FCA，包封式涂敷受试物致敏。

48. 第五节 皮肤光敏性试验 光敏性反应由太刚光线与制剂相作用而产生。凡含有类似已知光敏性物质或根据其他试验推测可能有光敏性的黏膜外用药，均应做光敏性试验。 一、动物 原则上选样敏感性高的动物。一般用白色豚鼠，500g以下(即1～3个月龄)，雌雄各半，雌性动物应是来受孕过的功物。每组10只，或由是否会影响结果评价决定。 二、阳性对照 6—甲基香豆素、3，3’，4’，5—四氯水杨酸苯胺等。

49. 三、受试物 受试物如为膏剂或液体剂型，可直接涂抹于去毛皮肤；如是固体粉末或中药散剂，需加适量水或其他赋形刑(如羊毛脂、凡士林、橄榄抽等)混合均匀，以保证受试物与皮肤接触良好。 确定剂量应考虑受试物的溶解性等理化性质，局部、全身的耐受性等。必要时应能陈述所用剂量的理由。 四、注意事项及结果评价 1．注意事项 实验动物的选择同皮肤过敏性试验。受试物的处理同皮肤过敏性试验。 结果报告时要注明光照条件，包括：装置概要、光源种类、制造厂家、亮度或强度、光照距离等。 2、结果评价 同皮肤过敏性试验。

50. 第六节 黏膜刺激性试验 试验目的是观察接触受试物后产生的动物黏膜刺激反应情况。分为单次给药和多次给药的黏膜刺激试验。 一、动物 首选成年健康的白色家兔(2kg左右)，其次是大鼠(0．25kg左右)。雌雄各半。婴儿用药应用更年轻的动物，如白色家兔1．5kg左右，白色豚鼠0．2kg左右。 二、受试物 应尽量与临床用制刑—致。粉末或中药散剂，需加适量水或其他赋形刑时，也应参考临床使用方法，合理配制。