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Marquage fluorescent de protéines

Marquage fluorescent de protéines. Représentation tridimentionnelle de DnaK. Représentation tridimentionnelle de DnaJ. Représentation tridimentionnelle Insuline. Etude de la fonctionnalité de Dnak après marquage. Choix du fluorophore Marquage Vérification de la fonctionnalité.

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Marquage fluorescent de protéines

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Presentation Transcript

  1. Marquage fluorescent de protéines Représentation tridimentionnelle de DnaK Représentation tridimentionnelle de DnaJ Représentation tridimentionnelle Insuline A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  2. Etude de la fonctionnalité de Dnak après marquage • Choix du fluorophore • Marquage • Vérification de la fonctionnalité A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  3. Le choix du fluorophore • Contraintes selon les groupements présents chez les chaperones • Groupement amine (lysine) • Groupement sulfhydryle (cystéine) Groupement amine Groupement sulfhydryle A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  4. Contraintes selon la structure tridimensionnelle de DnaK Site de liaison de l’ATP Emplacement de la Cystéine 15 A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  5. Contraintes selon la structure tridimensionnelle de DnaK Emplacement des Lysines A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  6. Le choix du fluorophore Cys Lys A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  7. Marquage fluorescent de protéines • Protéine dénaturée: Insuline • Chaperones : DnaK et DnaJ • Fluorophore: ALEXA FLUOR 488 (λexcitation = 480 nm ; λémission = 540 nm) • But : - Lier covalement un fluorophore à la chaperone. - Vérification de la fonctionnalité de Dnak après marquage - Déterminer les sites de liaison de la Dnak à l’insuline gràce à la fluorescence( microscopie optique). A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  8. Marquage de Dnak • Préparation de DnaK (tampon) • Fixation du dye avec DnaK • Vérification du marquage A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  9. Dnak 50 L 28,6*10-6 mol/L Dye 11,6 L 3,11*10-5 mol/L Tampon TRIS 10,0 L 50*10-3 mol/L Préparation de Dnak & fixation du dye Attente d’une heure et demi A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  10. Vérification du marquage par absorbance •  d’absorbance de la protéine : 280 nm •  d’absorbance du dye : 490 nm - tampon - dye + tampon - dye + Dnak + tampn CDnak = 23*10-6 mol/L (20,0*10-6 mol/L initial) Cdye = 1,1*10-6 mol/L (5,0*10-6 mol/L initial)

  11. Vérification du marquage A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  12. Vérification du marquage A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  13. Vérification de la fonctionnalité de DnaK après marquage • Particularité de l’insuline : formation de fibres amyloides Insuline en solution Fibre amyloïde Agrégat • Fonction de DnaK : réguler la formation des fibres DnaK Agrégat A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  14. Vérification de la fonctionnalité de DnaK après marquage • Détection de la formation des fibres amyloides: deux méthodes • Mesure de l’absorbance à 600 nanomètres • Reflete la turbidité de la solution • Utilisation d’un fluorophore: la thioflavine T • Deux longueurs d’onde d’excitation différentes suivant sa position A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  15. Vérification de la fonctionnalité de DnaK après marquage Expériences : - plaque 96 puits - insuline - insuline + colorant - insuline + DnaK non marquée - insuline + DnaK non marquée + DnaJ - insuline + DnaK marquée (1:4) - insuline + DnaK marquée (1:3) - mesure de l’absorbance toutes les heures A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  16. Vérification de la fonctionnalité de DnaK après marquage Résultats: A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  17. Expériences futures • Microscopie optique • Marquage et étude de la fonctionnalité de DnaJ • Etude cinétique Double marquage du noyau des cellules (en bleu) et d’une protéine (en vert) A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

  18. Bibliography http://www.pdb.org/pdb/home/home.do http://expasy.org/ http://www.uniprot.org/ http://www.piercenet.com/ http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescent_labelling A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

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